مهندسی پروتئین آنزیم اندوگلوکاناز قارچی از طریق ایجاد جهش هدفمند به منظور بهبود خصوصیات آنزیمی و بیان آن در مخمر
Abstract
زمینه: استفاده از سوخت های فسیلی باعث افزایش بهای آن و کاهش منابع شده است. لذا منابع تجدیدپذیر انرژی و تولید سوخت های زیستی مورد توجه قرار گرفته است. ترکیبات سلولزی از مناسب ترین مواد اولیه برای تولید سوخت های زیستی می باشد. تجزیه سلولز تنها توسط میکروارگانیسم هایی که حاوی آنزیم سلولاز هستند، انجام پذیر است که مهم ترین آن ها قارچ trichoderma reesei می باشد. روش ها: توالی نوکلئوتیدی آنزیم اندوگلوکاناز ii که از کلیدی ترین آنزیم های این کمپلکس و آغازگر حمله به زنجیره سلولزی است، از روی توالی آمینواسیدی آن در قارچt.reesei براساس ترجیح کدونی میزبان یعنی مخمر پیکیاپاستوریس سنتز شد. به منظور تولید آنزیم های بهینه و کاهش زمان تولید و بهای آنزیم از مهندسی پروتئین استفاده می شود و از انواع آن ایجاد جهش هدفمند است که در آن جایگزینی آمینواسیدها صورت می گیرد. در این تحقیق با کمک روش ایجاد جهش هدفمند، دو جهش در ژن آنزیم اندوگلوکاناز ii از طریق pcr ایجاد شد که در آن دو سیستئین آزاد شماره 169 و 393 به ترتیب به آمینواسیدهای والین و هیستیدین تبدیل شدند. سپس این ژن جهش یافته به پلازمید بیانی ppinkα وارد و جهت تکثیر به باکتری اشرشیاکلای و سپس از طریق الکتروپوریشن به مخمر پیکیاپاستوریس منتقل شد. یافته ها: ایجاد دوجهش مذکور بر روی این ژن از طریق تعیین توالی تأیید شد. حضور آنزیم پس از بیان ژن موردنظر در محیط bmmy، با تست دی نیتروسالیسیلیک اسید و ژل sds-page اثبات گردید. نتیجه گیری: با بررسی خصوصیات بیوشیمیایی نشان داده شد که دو جهش ایجادشده به طور همزمان در مقایسه با آنزیم فاقد جهش، باعث کاهش قدرت کاتالیتیکی و پایداری حرارتی و افزایش میل ترکیبی آنزیم و سوبسترا شده است.