ارزیابی بلوغ آزمایشگاهی و فراساختار کمپلکس های تخمک – کومولوس گوسفند پس از انجماد شیشه ای با روش های conventional ،cryotop ، و solid surface
Abstract
هدف این تحقیق بررسی تأثیرات انجماد شیشه ای کمپلکس های تخمک–کومولوس (توده های coc) گوسفند بر بقای توده ها، بلوغ تخمک ها، بیان ژنهای بلوغ و آپوپتوزی، شیوع ناهنجاریهای کروموزومی و تغییرات فراساختاری توده ها بود. توده های coc جدا شده دارای کیفیت خوب به چهار گروه، غیرانجمادی کنترل، انجمادی conventional straw ، cryotop و solid surface تقسیم شدند. در گروههای انجمادی conventional straw وcryotop، توده های منجمد شیشه ای شده به ترتیب در درون نی انجمادی و بر روی نوک نوارcryotop قرار گرفتند و مستقیماً در نیتروژن مایع غوطه ور شدند درحالیکه در گروه انجمادی solid surface، توده های منجمد شیشه ای شده پس از قرار گرفتن بر رویcryotop ، ابتدا سرد و سپس به نیتروژن مایع منتقل شدند. پس از بررسی بقا، توده های coc سالم به همراه توده های تازه گروه کنترل، در شرایط آزمایشگاهی بالغ شده و وضعیت هسته ای تخمک ها ارزیابی شد. علاوه بر آن، بیان نسبی ژنهای بلوغ و آپوپتوزی با روش کمی real-time pcr مورد ارزیابی قرار گرفت و شیوع ناهنجاری کروموزومی نیز با روش کاریوتیپ بررسی شد. در آخر، تغییرات فراساختاری توده های منجمد شده و تخمک های منجمد و بالغ شده نیز بین گروههای مختلف مقایسه شد. نتایج نشان داد که میزان بقای توده های منجمد و ذوب شده در گروههای cryotop و solid surface نسبت به گروه conventional straw بالاتر بود (به ترتیب 2/85 ± 83/84 و 1/72 ± 78/56 در برابر 1/48 ± 63/43% ، 0/05>p)، بعلاوه اگر چه در گروه cryotop، میزان بلوغ تخمک ها شبیه به گروه کنترل بود (3/09 ± 48/81 در برابر 3/01 ± 51/94%) ولی در مقایسه با سایر گروههای انجمادی درصد بالاتری داشت (3/09 ± 48/81 در برابر 1/69 ± 36/60 و 2/51 ± 6/09% ، 0/05>p). با وجود کاهش بیان نسبی ژنهای بلوغ (gdf9 و bmp15) پس از انجماد شیشه ای، گروه cryotop در میان گروههای انجمادی، بیشترین بیان را به خود اختصاص داده بود. بالاترین میزان بیان گیرنده bmprii در گروه کنترل بود، در حالیکه گیرنده alk5 میزان بیان مشابهی را در تمام گروهها داشت. بیان ژنهای پروآپوپتوزی (بجزbax) و ضدآپوپتوزی در گروه cryotop در مقایسه با سایر گروههای انجمادی بیشتر بود. ژن bax در گروه solid surface بیش از حد بیان شده بود. گروه conventional straw نیز پایین ترین میزان بیان ژنهای آپوپتوزی را نشان داد. میزان شیوع ناهنجاری کروموزومی در گروه cryotop نسبت به گروه کنترل بیشتر بود (5/42 در برابر 20% ، 05/0<p). همچنین نتایج بررسی های فراساختاری نشان داد که انجماد شیشه ای با روشهای cryotop و solid surface سازمان دهی کلی اووپلاسم را حفظ کرده در حالیکه انجماد conventional straw این سازمان دهی را بهم ریخته بود. علاوه بر آن پس از انجماد شیشه ای، تعداد واکوئل ها در اووپلاسم افزایش یافت، گروهی از این واکوئل ها به صورت جزیی یا کامل با چربی پر شده و گروهی نیز دارای داربست میکروفیلامنتی بودند. در تمام گروههای انجمادی، توزیع میتوکندریها به حالت گروه گروه در اطراف قطرات چربی در آمده بود و پس از انجماد conventional straw، میتوکندریهای متسع و حتی پاره نیز مشاهده شدند. اتصالات فاصله دار میان تخمک و سلول های کومولوس اطراف و کمپلکس های اتصالی بین سلول های کومولوس در دو گروه انجمادی cryotop و solid surface به خوبی حفظ شده در حالیکه در گروه انجمادی conventional staw، سلول های کومولوس زوایدشان را از منطقه شفاف به عقب کشیده بودند. در تخمک های بالغ نیز از تعداد و تراکم گرانولهای قشری پس از انجماد conventional straw و solid surface کاسته شده بود. در نهایت، انجماد با روش cryotop در مقایسه با دو روش انجمادی دیگر روش مطمئنی بنظر رسیده و می تواند بقا، بلوغ پس از ذوب و میزان بیان ژنهای بلوغ را افزایش دهد و همانند گروه کنترل سبب القای مرگ سلولی از طریق مسیر آپوپتوزی گردد. بعلاوه این روش فراساختار توده های coc را نیز بخوبی حفاظت می کند ولیکن کاستی هایی در زمینه حفظ سازمان دهی کروموزومی تخمک از خود نشان می دهد.