جداسازی وکلونینگ ژن pds (phytoene desaturase) از جلبک دونالیلای جداسازی شده از دریاچه های آب شور ایران
Abstract
جلبک تک سلولی دونالیلا موجودی مقاوم به شوری است که تحت شرایط تنش شوری بالا، کمبود مواد غذایی و نور شدید، موادی از قبیل کاروتنوئید و گلیسرول تولید می کند. با توجه به اهمیت کارتنوئیدهایی از قبیل بتاکاروتن در صنایع مختلف، جداسازی ژنهای کلیدی موثر در مسیر بیوسنتز کارتنوئیدها، به منظور بررسی روند تکاملی مسیر بیوسنتزآنها وانتقال و بیان این ژنها در میزبانهای مستعد، جهت افزایش عملکرد تولید، مورد توجه قرار گرفته است. ژن pds که از ژنهای کلیدی مسیر سنتز کاروتنوئید ها می باشد، عامل دهیدروژنه کردن ماده بی رنگ phtoene وتبدیل آن به لیکوپن می باشد. برای بیان ژن مذکور، این جلبک در محیط آزمایشگاه، تحت تنش شوری با غلظت 3 مولار و نور شدید (400 میکرومول فوتون بر متر مربع در ثانیه) قرار گرفت. سپس از جلبک نمونه گیری شده(در تیوپ های 5/1 سی سی) و rna کل استخراج گردید. واکنش rt-pcr با استفاده از rna کل انجام گرفت و cdna تک رشته ای کل تهیه گردید. واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از cdna بدست امده از مرحله قبل وپرایمرهای اختصاصی ژن pds، انجام گردید.محصول pcr که ژن pds بود به پلاسمید ptz57r/t متصل شد و به باکتری اشریشیاکلی سویه gh5? منتقل گردید. باکتری های اشریشیاکلی در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 12 ساعت نگهداری شدند. پس از آن، dna پلاسمیدی باکتری ها استخراج شد. با استفاده از واکنش pcr با پرایمرهای اختصاصی ژن pds بر روی پلاسمیدهای استخراج شده و هضم آنزیمی dna پلاسمیدی با استفاده از آنزیمهای برشی hindiii و ecori جداسازی ژن مذکور تایید شد پلاسمید حاوی ژن pds جهت توالی یابی ارسال شد.