کلونینگ، بیان و ارزیابی ایمنی زایی ناحیه c-ترمینال پروتئین سطحی مروزوئیت-1 پلاسمودیوم ویواکس و فالسیپاروم در مدل حیوانی
Abstract
مالاریا یکی از مهمترین بیماریهای انگلی در جهان محسوب می گردد. مقاومت انگلهای plasmodium falciparum و plasmodium vivax به داروهای ضد مالاریایی، افزایش مقاومت پشه های آنوفل به حشره کشها، جابجایی جمعیت و تغییرات آب و هوایی، منجر به بازپدیدی مالاریا در جهان شده است. این عوامل نشان دهنده نیاز به تولید یک واکسن مالاریایی موثر در کنار سایر روشهای کنترلی جهت حذف این بیماری می باشند. اگرچه آنتی ژنهای کاندید واکسن متعددی از هر دو گونه p. falciparum و p. vivax شناسایی و ساختار آنها مشخص شده است، اما تولید یک واکسن جهانی موثر هنوز با چالشهای فراوانی روبرو است. یکی از دلایل این امر تنوع آنتی ژنی انگل در مناطق جغرافیایی مختلف است که از عوامل بازدارنده در تولید واکسنهای مالاریایی می باشد. ناحیه انتهای کربوکسیل ژن msp-1 (msp-119) از مهمترین آنتی ژنهای کاندید واکسن مرحله خونی انگل مالاریا در هر دو گونه p. falciparum و p. vivax می باشد. pvmsp-119 و pfmsp-119 جدا شده از انگلهای مناطق مختلف جهان، تنوع آنتی ژنی در توالی اسیدآمینه ای را نشان می دهند در حالیکه چنین اطلاعاتی در مورد ایزوله های ایرانی p. falciparum و p. vivax در دست نمی باشد. بنابراین تعیین میزان پل مورفیسم pvmsp-119 و pfmsp-119 انگلهای منطقه آندمیک مالاریا در ایران امری لازم و ضروری است. جهت بررسی میزان تنوع در ژن کد کننده msp-119 در هر دو گونه، این ژن به ترتیب در 373 (173 نمونه از پارس آباد و 200 نمونه از چابهار) و 150 نمونه از ایزوله های کلینیکی p. vivax و p. falciparum تکثیر شد. در نمونه های pfmsp-119 مورد مطالعه هر دو تیپ آللی (89%) mad20 و (5/6%) k1 مشاهده شد. نتایج تعیین توالی ژن pfmsp-119 در 92 ایزوله، حضور 5 هاپلوتیپ مختلف a1 (e-tsr-l, 20/92)، a2 (q-kng-f, 14/92)، a3 (e-kng-f, 14/92) ، a4 (e-tsg-l, 26/92) و a5 (q-kngl, 18/92) را نشان داد. e-tsg-l، هاپلوتیپ غالب در ایران، قبلاً از تایلند و هند گزارش شده است. از طرفی هاپلوتیپ e-kng-l که شیوع فراوانی در آفریقا، آسیا و آمریکای لاتین دارد، در ایزوله های ایرانی مشاهده نشد. آنالیز تعیین توالی ژن pvmsp-119 در 80 نمونه (60 ایزوله از جنوب و 20 نمونه از شمال غرب) نشان دهنده حفاظت 100% در ایزوله های ایرانی بود. نتایج این مطالعه مبنی بر حفاظت بسیار زیاد در ژن pvmsp-119 و تنوع ژنتیکی محدود در ژن pfmsp-119 نشان می دهد که می توان از هر دو آنتی ژن pvmsp-119 و pfmsp-119 در طراحی واکسن پلی والانت منطقه ای استفاده نمود. علاوه بر این، مطالعات ایمونواپیدمیولوژی در مناطق مختلف آندمیک مالاریا با میزان انتقال و ژنتیک انسانی متفاوت، اطلاعات مهمی را در درک پاسخ های ایمنی میزبان به p. vivax و p. falciparum فراهم می کند که می تواند در طراحی واکسن موثر علیه این گونه ها مورد استفاده قرار گیرد. بنابراین هدف دوم از این مطالعه، ارزیابی پاسخ آنتی بادی طبیعی به آنتی ژنهای نوترکیب pvmsp-119 و pfmsp-119 در بیماران مبتلا به p. vivax و یا p. falciparum منطقه هیپوآندمیک ایران جهت درک و فهم از برخورد متقابل انگل و میزبان به منظور تولید واکسن بر پایه msp-119 بود. در این مطالعه، وضعیت زیرکلاسهای igg و اویدیتی آنها نسبت به پروتئینهای rpvmsp-119 و rgst-pfmsp-119 در افراد منطقه آندمیک مالاریا در چابهار که بطور طبیعی در معرض انگلهای (94 = n) p. vivax و (92 = n) p. falciparum قرار دارند، ارزیابی شد. در افراد آلوده به عفونت فعال p. vivax و p. falciparum، به ترتیب 1/86% و 8/72% دارای آنتی بادی igg علیه rpvmsp-119 و rgst-pfmsp-119 بوده و igg1 زیرکلاس غالب علیه هر دو آنتی ژن (9/81%) rpvmsp-119 و (5/78%)rgst-pfmsp-119 بود. علاوه بر این، جهت تعیین پایداری آنتی بادیهای igg، igg1 و igg3 به rpvmsp-119 و rgst-pfmsp-119، فراوانی این آنتی بادیها در افرادی از گروه عفونت فعال ویواکسی (74 = n) و فالسیپارومی (14 = n)، پس از درمان استاندارد با کلروکین ارزیابی شد. نتایج نشان داد که فراوانی آنتی بادیهای igg، igg1 و igg3 به ترتیب به 3/51%، 51% و 2/16% (pvmsp-119) و 4/71%، 2/64% و 1/14% (pfmsp-119) کاهش یافت. اویدیتی آنتی بادیهای igg ضد pvmsp-119 در نمونه های سرمی مثبت اندازه گیری شد و نتایج نشان دهنده اویدیتی بالای آنتی بادیهای igg، igg1 و igg3 به ترتیب در 6/66%، 61% و 47% از افراد آلوده به عفونت فعال p. vivax بود. در حالیکه اویدیتی بالای آنتی بادیهای igg، igg1 و igg3 به ترتیب در 7/62%، 75/50% و 62/47% از افراد آلوده به عفونت فعال p. falciparum یافت شد. این نتایج نشان می دهد که افراد در معرض مالاریای ویواکسی و فالسیپارومی در منطقه آندمیک مالاریای ایران، آنتی بادیهایی با اویدیتی بالا علیه rpvmsp-119 و rgst-pfmsp-119 تولید می کنند. این اطلاعات در درک بهتر واکنشهای متقابل میزبان و انگلهای p. vivax و یا p. falciparum جهت توسعه واکسن ساخته شده بر پایه msp-119 در مناطق آندمیک کمک خواهد کرد. در بیماری مالاریا، آنتی بادیها و سلولهای t نقش مهمی را در حفاظت علیه عفونتهای p. vivax و p. falciparum به عهده دارند. البته قابل ذکر است که ایمن سازی با msp-119 نوترکیب منجر به ایجاد ایمنی محافظت کننده نسبی از طریق آنتی بادیها می شود. بنابراین، سومین هدف این تحقیق، بررسی میزان افزایش یا کاهش پاسخ های ایمنی در موشهای ایمن شده با دو آنتی ژن به صورت ترکیبی که در یک محل تزریق شده اند و با استفاده از استراتژیهای مختلف می باشد. نتایج نشان داد که موشهای ایمن شده با دو آنتی ژن نوترکیب به تنهایی و یا به صورت ترکیبی با استفاده از روش prime-boost هتروژن (تزریق prime با µg 100 از dna و boost با µg 35 از پروتئین نوترکیب) سبب القاء تولید میزان قابل توجهی از آنتی بادیهای igg1،igg2a و igg2b (مخلوطی از پاسخ th1/th2) می شود که با روش elisa اندازه گیری شدند. همچنین هر دو آنتی ژن سبب القاء افزایش تولید ifn-? و il-10 در موشهای ایمن شده گشتند. استفاده از مخلوط دو آنتی ژن نوترکیب به روش prime-boost، پاسخ آنتی بادی، ifn-? و il-10 مشابهی در مقایسه با استفاده از هر یک از این آنتی ژنها به تنهایی با این روش القاء نمود. بنابراین مطالعه حاضر استراتژی جدید استفاده از تزریق دو آنتی ژن در یک جایگاه را جهت توسعه واکسنهای مرحله خونی مالاریا پیشنهاد و معرفی می کند. در نهایت می توان نتیجه گرفت که ناحیه انتهایی کربوکسیل پروتئین pv/pfmsp-119 را می توان در طراحی واکسن پلی والانت علیه هر دو گونه در این منطقه ازجهان استفاده نمود.