ادغام t-dna در گیاه datura metel l. و بررسی تولید آلکالوئید ها در شرایط کشت in vitro
Abstract
چکیده گیاه datura metel l. سرشار از آلکالوئیدهای مهم دارویی وتجاری است، که عبارتند از: هیوسیامین، اسکوپولامین و آتروپین. بنابراین به کارگیری روش های کشت سلولی و طراحی سیستم هایی که افزایش پتانسیل تکثیر و به دنبال آن ازدیاد متابولیت های ثانویه را در بردارند، در مورد این گیاه ضروری به نظر می رسید. روش های مختلفی برای تغییر در میزان ترکیبات ثانویه گیاهی وجود دارد. که از آن جمله می توان به اعمال موتاسیون، ایجاد تغییرات سوماکلونال و انتقال t-dna به گیاه اشاره کرد. در مطالعه حاضر ابتدا شرایط باززائی گیاه از قطعات برگ بهینه گردید و بهترین محیط کشت با بالاترین در صد باززائی (79 در صد) در محیط کشت ms حاوی ? میلی گرم در لیتر bap به دست آمد. در سیستم های باززائی گیاه گاهی احتمال وقوع تغییرات ژنتیکی و یا اپی ژنتیکی مطلوب وجود دارد. به منظور بررسی این موضوع، گیاهان باززائی شده با استفاده از پرایمر های rapd مورد بررسی قرار گرفتند. در بین پرایمر های استفاده شده پرایمر fpk2-19 بیشترین تنوع ژنتیکی را نشان داد. پس از بهینه سازی محیط باززایی اقدام به انتقال t-dna به گیاه، با استفاده از agrobacterium tumefaciens حاوی پلاسمید pzm1047، در برگیرنده ژن های gus و kan نمودیم. نرخ ترانسفورماسیون در این پژوهش حدود 13 درصد به دست آمد. که نسبت به درصد گزارش شده توسط محققان قبلی 2 درصد افزایش داشت. بعد از باززایی از گیاهان تراریخت چندین لاین حاصل شد و آنالیز مقدار کمی آلکالوئید با استفاده از روش tlc در اندام های هوایی و همچنین ریشه گیاهان شاهد، باززایی شده و لاین های 1، 2 و 3 تراریخت صورت گرفت. در مجموع آتروپین کل در مورد لاین 2 تراریخت (t2) 04/83 درصد، افزایش معنی دار نسبت به شاهد نشان داد. همچنین لاین های 2 باززایی شده (r2)و لاین 1 تراریخت t1)) نیز به ترتیب افزایش 79/77 و 01/61 درصدی معنی دار نسبت به شاهد نشان دادند. از طرف دیگر لاین 3 باززایی شده ( (t340/9 درصد کاهش آتروپین کل نسبت به شاهد نشان داد. همچین نتایج بررسی آلکالوئید ها در اندام های هوایی نشان داد که گیاهان لاین 2 تراریخت با مقدار 97/164 در صد افزایش معنی دار آلکالوئید نسبت به شاهد بیشترین مقدار آلکالوئید را در بین گیاهان مورد بررسی نشان دادند. این در حالی بود که ریشه های این لاین با 25/94 درصد کاهش معنی دار آلکالوئید نسبت به شاهد دارای کمترین مقدار آلکالوئید در بین گیاهان مورد برررسی هستند. در مجموع آنالیز آلکالوئید های ریشه روندی را عکس روند ساقه نشان داد. این می تواند تأییدی بر سنتز آلکالوئید ها در ریشه و انتقال آن ها به اندام های هوایی باشد. در رابطه با علت اختلاف بین سطوح آلکاوئید گیاهان باززایی شده و شاهد می توان به این مسئله اشاره کرد که وقوع تغییرات ژنتیکی سوماکلونال و وجود باند bp ??00 در لاین 2 (r2) باعث افزایش 79/77 درصدی معنی دار آتروپین کل نسبت به شاهد شده است. همچنین انتقال t-dna به گیاه نیز، احتمالاً با تأثیر بر ژن های سنتز کننده آلکالوئید و تغییر بیان آن ها تغییر میزان آلکالوئید ها را به دنبال داشته است.