همسانه سازی ژن عامل آنزیم 1- آمینو سیکلوپروپان-1- کربوکسیلیک اسید اکسیداز (aco1) از بافت میوه گوجه فرنگی (lycopersicon esculentum l.)
Abstract
آنزیم 1- آمینوسیکلوپروپان-1- کربوسیلکیک اسید اکسیداز (aco) عضوی از خانواده اکسیدوردوکتازهای وابسته به آهن ii است و برای فعالیت خود به fe2+ به عنوان کوفاکتور و آسکوربات به عنوان سوبسترای همراه نیاز دارد. این آنزیم مرحله نهایی بیوسنتز اتیلن را کاتالیز می کند و حداقل چهار ایزوفرم این ژن (leaco1-4) در گوجه فرنگی شناسایی شده است. با کاهش بیان ژن مذکور در سیستم گیاهی از طریق فناوری آنتی سنس می توان به میوه های تراریخته ای دست یافت که فرآیند رسیدن در آن ها به کندی صورت گیرد و از این طریق میزان ماندگاری آن ها افزایش یابد. در این تحقیق، پس از استخراج rna کل از بافت میوه گوجه فرنگی (lycopersicon esculentum l. cv, memory i) و سپس سنتز dna مکمل، ژن leaco1 با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز، از بافت میوه جداسازی شده و در ناقل پلاسمیدی puc19 همسانه سازی شد. پلاسمیدهای نوترکیب به باکتری e. coli سویه dh5? تراریخت شدند. در نهایت پلاسمید نوترکیب با استفاده از سه روش هضم آنزیمی، pcr و توالی یابی dna تائید شدند. نتایج توالی یابی نشان داد که ژن استخراج شده از گیاه گوجه فرنگی دارای 99% مشابهت با ژن leaco1 (x58273) ثبت شده در پایگاه اطلاعات genbank می باشد. توالی اسید آمینه نیز با توالی اسید آمینه آنزیم در این پایگاه 100% شباهت داشت. بررسی توالی اسید آمینه ای پروتئین aco1 در گوجه فرنگی و سایر گیاهان حضور دو موتیف (his-x-asp-x-his) و (arg-x-ser) را که در اتصال کوفاکتور fe2+ و سوبسترای همراه آسکوربات نقش دارند، تائید کرد. مطالعه ساختار دو بعدی این پروتئین با استفاده از برنامه scratch، به حضور 10 مارپیچ آلفا، 12 صفحه بتا و دو باند دی سولفیدی اشاره دارد. پیش بینی موقعیت زیر سلولی آنزیم با استفاده از نرم افزار psort نشان داد که محل فعالیت آنزیم aco1 درون سیتوپلاسم می باشد.