کلونینگ وتعیین (hsp70 (c-terminal از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در وکتور بیانی pqe-30
Abstract
پروتئینهای شوک حرارتی (hsp) ،از مایکو باکتریوم توبرکلوزیس، توسط سلولهای t شناسایی می شوند و لذا می توانند در همراهی با آنتی ژنهای مناسب پاسخ ایمنی قابل قبولی را بر علیه عفونتهای ویروسی، عفونتهای باکتریال و یا سایر عوامل عفونی القا نمایند. مهمترین دلیل ما نیز برای استفاده از ( c-terminal )hsp70 359-610 ،خاصیت adjuvant قوی این بخش از مولکول hsp70 است. این مولکولها می تواند پاسخ سلولهای ایمنی را افزایش دهند ؛علاوه براین می توانند باعث پیشرفت اثرات درمانی تولید شده بوسیله واکسنهای نوترکیب شوند. ما در این تحقیق در مرحله اول ، اقدام به طراحی پرایمر برای جداسازی ژن hsp70 از باکتری سل نمودیم. پس از بهینه نمودن شرایط pcr ،با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ،قطعه ( c-terminal )hsp70 359-610 مورد نظر تکثیر گردید ؛سپس بر روی ژل 1% برده شد،تخلیص گردید و پس از تخلیص قطعه مورد نظر از روی ژل 1%به کمک تکنیک t/a وکتور بداخل وکتور ptz57r/t dna کلون گردید .در نهایت هضم آنزیمی وکتور بیانی pqe-30 وبطور جداگانه وکتور کلونینگ ptz57r/t dna که حاوی قطعه مورد نظر ماست بوسیله آنزیمهای, bamhi hindiii انجام گرفت که در نتیجه آن وکتور pqe-30 به حالت linear در آمد ونیز قطعه ( c-terminal )hsp70 359-610 از داخل وکتور کلونینگ فوق بیرون کشیده شد .سپس عمل ligation میان وکتورpqe-30 و dnaتخلیص شده از ژل انجام شد و سرانجام آنالیز پلاسمید نوترکیب با استفاده از هضم آنزیمی ،تائید کلونینگ (تایید اولیه با استفاده از ژل الکترو فورز و تایید نهایی با استفاده از pcr )و در آخر تعیین توالی ژن hsp70 صورت گرفت ؛ پس از کلون شدن ژن hsp70 درون پلاسمید pqe-30 منطقه مورد نظر (منطقه واقع بین دو جایگاه , bamhi hindiii) تعیین توالی شد.درنهایت صحت و انطباق کلونینگ ژن با pcr ، هضم آنزیمی و تعیین توالی ژن تایید شد.