ردیابی، تکثیر و کلونینگ ژن fom2 و بررسی تنوع آن در توده های محلی بومی خربزه ایران
Abstract
بیماری زردی و پژمردگی آوندی یکی از بیمار های مهم خربزه می باشد که قارچ fusarium oxysporum f.sp. melonis (fom) عامل این بیماری است و از نظر بیماریزائی در چهار نژاد صفر، 1، 2و 1.2 گروه بندی می شود. ژن fom2 به عنوان عامل مقاومت در مقابل نژاد صفر و 1 قارچ fom شناخته شده است. در این مطالعه با توجه به حساسیت اکوتیپ های خربزه ایرانی در مقابل نژاد 1، حضور ژن fom2 به عنوان عامل مقاومت در برابر این نژاد در سطح ژنوم اکوتیپ های مثل: طالبی شهد شیراز، خربزه مشهدی، خربزه خاتونی، خربزه خاقانی، charentais fom1 و charentais fom2 مورد بررسی قرار گرفت. توالی گزارش شده ژن fom2 از بانک ژن بازیابی شد و با انجام آنالیزهای بیوانفورماتیک مناطق حفاظت شده آن تعیین و جهت طراحی پرایمر داخلی (psh20-f/r) به کار گرفته شد. نتایج pcr با استفاده از این پرایمر حضور ژن fom2 را در اکوتیپ های مورد مطالعه تایید نمود و به تکثیر تک باند در اندازه مورد انتظار منتج شد. قطعه داخلی ژن fom2 جهت توالی یابی در ناقل ptg19 کلون شد و به وسیله تکنیک کلنی pcr با استفاده از پرایمر داخلی ژن fom2 و پرایمر یونیورسال psh10.2-f/r تایید گردید. آنالیز نتایج توالی یابی نشان داد که اکوتیپ های حساس همانند خربزه مشهدی، خربزه خاقانی، charentais fom1 تنوع نوکلئوتیدی و پروتئینی متفاوتی را نسبت به اکوتیپ های مقاوم نشان می دهند، که همین تنوع نوکلئوتیدی، ساختار پروتئینی اکوتیپ های حساس را تغییر و آن ها را نسبت به نژاد صفر و 1 عامل بیماری حساس می نماید. شناسایی تفاوت سطح مقاومت در اکوتیپ ها به دلیل وجود تنوع در توالی ژن و در سطح بیان پروتئینی ژن fom2 می باشد. سپس به منظور بررسی توالی کامل ژن fom2 و همسانه سازی آن، یک جفت پرایمر اختصاصی (psh20.2-f/r) بر اساس ابتدا و انتهای ژن، جهت تکثیر توالی کامل ژن طراحی گردید. با توجه به مقاوم بودن اکوتیپ طالبی شهد شیراز (m6) ژنوم این اکوتیپ پس از استخراج بعنوان dna الگو مورد استفاده قرار گرفت. در الگوی الکتروفورزی محصول pcr تک باندی به اندازه مورد انتظار (حدود 3.3 کیلوباز) مشاهده شد. بعد از کلون کردن قطعه مورد نظر در ناقل ptg19 و توالی یابی، آنالیز نتایج وجود موتاسیون را در اکوتیپ مقاوم طالبی شهد شیراز مشخص نمود که این موتاسیون ها بر عملکرد ژن fom2 تاثیر نداشته است. به طور کلی هدف از کلون قطعه کامل در این تحقیق انتقال ژن fom2 به ناقل بیانی و بعد از آن انتقال ژن به گیاه می باشد، که در مطالعات تکمیلی مورد بررسی قرار خواهد گرفت. fom2