شناسایی عامل لکه برگی پامچال در استان مازندران با استفاده از توالی ژن‌های rpoD و dnak

بیماری لکه برگی ناشی از گونه‌ای زانتوموناس در پامچال وحشی (Primula vulgaris) در چند منطقه جنگلی استان مازندران گزارش شده است (Rahimian. 1995. 12th  Iran. Plant Protec. Cong.,278). براساس یک بررسی ژنومی از تعیین توالی ناحیه ITS و ژن 16s rRNA گزارش گردید که برخی از جدایه‌های عامل لکه برگی پامچال نزدیک به گونه X.campestris می‌باشند (Rahimian et al. 2008. 18th  Iran. Plant Protec. Cong.,420)، ولی اطلاع دقیقی از موقعیت تاکسونومیکی این جدایه‌ها در دسترس نیست. بررسی حاضر به منظور ارزیابی موقعیت تاکسونومیکی جدایه‌های به‌دست آمده از چند منطقه جنگلی استان مازندران انجام گرفت. ازکشت نمونه‌های پامچال دارای علایم لکه برگی، جدایه‌هایی با کلنی‌های محدب زرد رنگ و لعابدار روی محیطNAS  به‌دست‌آمد. واکنش فوق حساسیت پس از تزریق سوسپانسیون باکتری به برگ‌های شمعدانی بعد از 24 ساعت و بیماری‌زایی روی برگ‌های پامچال پس از 7 تا 14 روز به اثبات رسید. نقوش الکتروفورزی پروتئین‌های سلولی اختلاف چندانی میان جدایه‌ها نشان نداد. از نظر ویژگی‌های فنوتیپی جدایه‌ها بسیار شبیه هم بوده و فقط در مصرف اسید سیتریک به عنوان منبع کربن اختلاف نشان دادند. DNA ژنومی جدایه‌ها استخراج و با به‌کارگیری آغازگرهای  dnakو rpoD قطعاتی از این دو ژن با PCR در شرایط توصیه شده پارکینسون و همکاران (Parkinson et al. 2007. Int. J. Syst. Evol. MicrobioI. 57:2881-2887) ولی با کاهش دمای مرحله اتصال (Annealing) تکثیر شد. محصول PCR در ژل آگارز 1% الکتروفورز و ژل در محلول ژل رد(gel red) رنگ‌آمیزی شد. به‌ترتیب دو قطعه 965 و736 bp از ژن‌های  dnakو rpoDتکثیر گردید. به منظور امکان تفکیک محصولPCR  جدایه‌ها از یکدیگر هضم محصول حاصل از تکثیر ژن‌های dnak وrpoDبا آنزیم  BamHIصورت گرفت. از ضریب تشابه جاکارد برای تعیین تشابه جدایه‌ها و از روش  UPGAMAو نرم‌افزار NTSYS برای آنالیز خوشه‌ای استفاده شد. نمونه‌های انتخاب شده براساس نتایج RFLP، توالی‌یابی شد. توالی نوکلئوتیدی به‌دست آمده، پس از همردیف‌سازی چندگانه (Multiple sequence alignment) با برنامه MEGA4 با سایر توالی‌های مربوط به این ناحیه در گونه‌های مختلف Xanthomonas موجود در ژن بانک (NCBI) مقایسه شدند. نتایج به‌دست آمده نشان داد جدایه‌ها درسطح تشابه 98% با گونه Xanthomonas hortorum شباهت داشته و احتمالاً به پاتوار گزارش نشده‌ای از این گونه تعلق دارند. این اولین گزارش از جدایه‌هایی از گونه X.hortorum به عنوان عامل بیماری لکه برگی در پامچال است.