انتقال ژن کیتیناز 36 (dna ژنومی) به گیاه کلزا و تایید مولکولی گیاهان تراریخت
Abstract
بیماری های قارچی از بزرگترین عواملی هستند که باعث افت شدید عملکرد در محصول می شوند. در این تحقیق بهینه سازی کشت بافت و شرایط انتقال ژن به گیاه کلزا لاین r line hyola 308 انجام پذیرفت. در بهینه سازی کشت بافت با انتخاب غلظت mg/l bap5/3 میزان باززایی به 112 درصد رسید. سه پارامتر مهم در انتقال ژن توسط آگروباکتریوم شامل زمان پیش کشت، زمان هم کشتی و غلظت استوسیرینگون مورد بررسی قرار گرفت. با استفاده از ژن gus که در وکتور pbi121 تحت بیان پروموتر camv 35s بود شرایط بهینه برای انتقال ژن بدست آمد. با بهینه سازی زمان پیش کشت به 48 ساعت، زمان هم کشتی باآگروباکتریوم به 48 ساعت و غلظت استوسیرینگون به 100 میکرومول میزان انتقال ژن از حد پایه 4 درصد به 33 درصد افزایش یافت. در مرحله بعد ژن کیتیناز36 همسانه سازی شده دروکتور pbi121 (pbimy3)، از طریق آزمون pcr و الگوی هضم آنزیمی مورد تأیید قرار گرفت. این پلاسمید نوترکیب به دو لاین r line hyola308 و rgs003 از طریق انتقال بوسیله آگروباکتریوم منتقل گشت. به منظور انتقال ژن به گیاه کلزا از برگ های لپه ای گیاهان 5 روزه با طول دمبرگی حدود 2 میلیمتر که جوانه انتهایی آنها به طور کامل حذف گردیده بود استفاده گردید. نمونه ها به محیط انتخابی حاوی کانامایسین و سفاتوکسیم منتقل گشتند. گیاهان تراریخت به علت وجود ژن مقاومت به کانامایسین می توانستند در این محیط تشکیل نوساقه های سبز رنگ دهند. حضور ژن کیتیناز 36 در گیاهان بدست آمده با استفاده از آزمون pcr با آغازگرهای اختصاصی chit36f/chit36r، rt-pcr، آزمون لکه گذاری dna، آزمون زیست سنجی و آزمون مطالعه فعالیت آنزیمی علیه قارچsclerotinia sclerotiorum اثبات گردید.