همسانه سازی ژن الکل دهیدروژناز (adh) در باکتری e.coli bl21
Abstract
اتانول تولیدی از زیست توده یکی از راهبردهای بی نظیر و سودمند از لحاظ اقتصادی و محیطی است و می تواند به عنوان یک سوخت پاک و ایمن، جایگزین سوخت های فسیلی مورد ملاحظه قرار گیرد. در سراسر جهان مقدار زیادی از زیست توده های لیگنوسلولزی موجود می باشد که می تواند به منظور استخراج و تولید اتانول زیستی مورد استفاده قرار گیرد. اخیراً پیشرفت های قابل ملاحظه ای در تولید اتانول زیستی از مواد لیگنوسلولزی بوجود آمده است. با توجه به آلودگی زیست محیطی و کاهش منابع فسیلی کشور، در طول یک دهه ی اخیر توجه جدی به تولید سوخت های زیستی و جایگزینی آن با سوخت های فسیلی شده است. با توجه به این مساله که تولید این سوخت ها توسط موجودات زنده میکروبی انجام می گیرد، بخشی مهمی از تحقیقات به انتخاب میکروارگانیسم های برتر جهت تولید و افزایش توان تولیدی آنها اختصاص یافته است. در این تحقیق ژن الکل دهیدروژناز (adh) از باکتری zymomonas mobilis به دلیل اینکه کلیدی ترین آنزیم در مسیر تولید اتانول زیستی می باشد انتخاب و در باکتری e.coli همسانه سازی گردید. جهت همسانه سازی این ژن از آغازگرهای اختصاصی ژن الکل دهیدروژناز و با استفاده از واکنش pcr ژن مورد نظر جداسازی و در مرحله بعد الحاق ژن adh در پلاسمید pet 28a، توسط آنزیم های محدود کننده sal i و xho i و آنزیم t4 لیگاز در دمای 16 درجه سانتی گراد انجام گردید و در ادامه، سلولهای شایسته باکتری e.coli توسط پلاسمید نوترکیب ترانسفورم گردید. جهت تایید باکتری های نوترکیب e.coli از چهار آزمون استفاده شد که اولین آزمون شامل کشت کلونی های باکتری در محیط کشت lb (حاوی کانامایسین به میزان mg 50) بود. نتایج کشت باکتری های تراریخت بر روی محیط حاوی کانامایسین نشان داد که تنها کلونی های محدودی قادر به رشد می باشند که حاوی پلاسمید 28a pet می باشند. در مرحله بعدی نتایج colony pcr با آغازگرهای اختصاصی ژن نشان داد که باند مربوط به ژن adh به اندازه حدوداً 1151 جفت باز قابل مشاهده می باشد. نتایج مربوط به pcr پلاسمید نوترکیب توسط آغازگرهای رفت پروموتور t7 و آغازگر برگشت ژن adh حاکی از درج صحیح ژن در پلاسمید بود (نتایج الکتروفورز محصولات این pcr بر روی ژل آگارز یک درصد باندی به اندازه 1336 جفت باز را آشکار کرد) و در نهایت نتایج الکتروفورز (ژل آگاروز 1?) محصول هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب توسط آنزیم های sal i و xho i باندهای مشابهی را آشکار کرد.