ارزیابی تولید آنزیم زایلاناز با به کارگیری تنش های عمومی وابسته به sigb در باسیلوس سوبتیلیس
Abstract
در پژوهش حاضر سامانه ای بیانی وابسته به پروتئین sigb در باسیلوس سوبتیلیس ساخته شد. پلاسیمد بیانی ساخته شده شامل ناحیه پروموتور ohrb، توالی سیگنال amyq، ژن زایلاناز از باسیلوس سوبتیلیس aq1 (بعنوان ژن هدف) و دنباله هیستیدینی بود. بیان ژن هدف در این سامانه بیانی با اعمال گرسنگی گلوکز در محیطی سنتزی محدود به گلوکز بررسی شد. نتایج نشان داد در طول فاز تاخیر و رشد نمایی پروتئین هدف تقریبا بیان نشده است. در اواخر فاز نمایی و اوایل فاز سکون، میزان تولید آنزیم به صورت ناگهانی افزایش یافته و به بیش از 41 واحد رسید که این نتیجه موید کنترل پذیری مناسب این سامانه در این محیط محدود به گلوکز است. بیان ژن هدف در سامانه بیانی ساخته شده با به کارگیری تنش های محیطی در lb و یک محیط کشت سنتزی بررسی شد. در نتیجه اعمال تنش های نمک (nacl)، گرما و اتانول در محیط lb به ترتیب افزایش 5، 6 و 15 برابری در فعالیت پروتئین هدف مشاهده شد. در تنش نمک بیشترین میزان فعالیت آنزیمی 40 دقیقه بعد از اعمال تنش حاصل شده و به مقدار 12 واحد رسید و در ادامه مقادیر فعالیت کاهش یافت. در تنش اتانول، 30 دقیقه بعد از اعمال تنش بیشینه میزان فعالیت آنزیمی در حدود 10 واحد حاصل شد. در تنش حرارتی، بعد از مدت 10 دقیقه فعالیت آنزیمی به 11 واحد رسید که در ادامه باکاهش فعالیت همراه بود. نهایتا از دقیقه 30 ام به بعد فعالیت افزایش یافت بطوریکه در دقیقه 60 به مقدار 13 واحد رسید. در مجموع بهترین بیان آنزیم و همچنین نسبت القاء مربوط به اعمال تنش نمک در محیط سنتزی بود. بطوریکه بیشترین میزان فعالیت آنزیمی 40 دقیقه بعد از اعمال تنش حاصل شده و به مقدار 15 واحد رسید در حالیکه پیش از اعمال تنش فعالیت زایلانازی مشاهده نشده بود. بررسی قابلیت خود القایی سامانه بیانی در تولید پروتئین هدف با انجام تخمیر چگالی سلولی بالای سویه نوترکیب در محیطی بر پایه گلوکز انجام شد. در پایان فرایند تخمیر، هم زمان با ورود سویه به فاز سکون افزایش چشم گیری در تولید آنزیم زایلاناز دیده شد. به طوری که فعالیت آنزیم ای از 3 واحد بر میلی لیتر در طی یک ساعت به 8 واحد بر میلی لیتر و متعاقبا با گذشت 4 ساعت دیگر به 10 واحد بر میلی لیتر رسید. افزایش ناگهانی فعالیت زایلاناز در اوایل ورود سویه به فاز سکون موید قابلیت خود القایی این سامانه بیانی بود. در شرایط مشابه، حداکثر تولید آنزیم زایلاناز توسط سویه شاهد 2 واحد بر میلی لیتر بود. تولید آنزیم زایلاناز توسط سویه شاهد به دلیل حضور ژن زایلاناز بر روی کروموزوم است. پروفایل فعالیت زایلاناز توسط این سویه نشان دهنده تولید وابسته به رشد این آنزیم است. در نتیجه ایجاد گرسنگی سلولی و یا اعمال تنش در باسیلوس سوبتیلیس، پروتئین sigb به حالت فعال در آمده و سبب بیان ژن هدف شده است.