طراحی، ساخت و بررسی زیست حسگری باکتریایی مبتنی بر پروتئین فلورسنت سبز با استفاده از اپرون tbua1ubva2c جهت تولوئن در دسترس زیستی
Abstract
امروزه آلودگی آب یکی از بزرگترین مشکلات نوع بشر می باشد و از میان ترکیبات آلوده کننده آب ترکیبات btex (بنزن، تولوئن، اتیل بنزن و زایلن) ترکیباتی هستند که طیف گسترده ای از بیماری ها را به همراه دارند. زیست گزارشگرهای باکتریایی یکی از ابزاری هستند که توانایی سنجش کیفی و تا حدودی کمی آلودگی های زیست محیطی را دارا می باشند و این پتانسیل را دارند که جهت غربالگری نمونه های محیطی قبل از آنالیز دقیق آنها با روش های استاندارد مورد استفاده قرار گیرند. بعضی از باکتریها و قارچها دارای ژنهایی هستند که محصول روشن شدن آنها آنزیمهایی با توانایی باز کردن این ترکیبات حلقوی به شکل خطی و مصرف نهایی آنها به صورت واسطه های چرخه کربس و در نهایت زیست پالایی این مواد می باشد. یکی از این موجودات تجزیه کننده ترکیبات btex باکتری ralstonia pickettii pko1 می باشد. اپرون tbua1ubva2c اولین آنزیم مسیر تجزیه ترکیبات btex را در این باکتری کد می کند و tbua1 بخش پروموتری این اپرون می باشد که آنزیم rna پلیمراز دارای زیر واحد 54 ? رونویسی از آن را انجام می دهد اما این آنزیم دارای تمایل بسیارکمی برای شروع رونویسی از tbua1می باشد. پروتئین فعال کننده رونویسی tbut مسئول کنترل مثبت این اپرون می باشد و این توانایی را دارد تا در حضور ترکیبات btex به توالی uas از این اپرون متصل شود و این کمپلکس حاصل با میان کنش با rna پلیمراز دارای زیر واحد 54 ? رونویسی از tbua1 را تقویت می کند. در این تحقیق یک توالی سنتزی ساخته شد که توانایی تولید پیوسطه tbut را داراست. ژن گزارشگر gfp در این توالی تحت کنترل پروموتر tbua1 بیان می شود و این استراتژی سبب می شود که در حضور ترکیبات btex باکتریهایی که این توالی سنتزی به صورت الحاق شده در ناقل pgem-7zf(+) به درون آن ها وارد شده است از خود پیام فلورسنس تولید کنند. در این تحقیق اثر عواملی مانند نوع محیط کشت، نوع میزبان، دمای کشت، مرحله رشد بر این زیست گزارشگر و پارامترهای اختصاصی بون، حساسیت و lod آن سنجیده شد و با سایر گزارشات مشابه مقایسه شده است. نتایج نشان می دهد نوع محیط کشت و مرحله رشد بر پاسخ زیست گزارشگر موثر است و دمای 37 درجه سانتیگراد بهترین دمای بررسی زیست گزارشگر می باشد. میزان lod تولوئن و زمان پاسخ بعد از القا به ترتیب 5 میکرومولار و 48 ساعت می باشد. پاسخ زیست گزارشگر به ترکیبات btex اختصاصی است و دارای بیشتری انتخاب پذیری به تولوئن می باشد. همچنین نتایج نشان داد پاسخ زیست گزارشگر به مخلوط ترکیبات btex جمع پذیر می باشد.