کلونینگ، بیان و جداسازی آنزیم آسپارتیل پروتئیناز ترشحی sap2 کاندیدا آلبیکنس در پیکیا پاستوریس

آنزیم آسپارتیل پروتئیناز ترشحیsap2 کاندیدا آلبیکنس نقش محوری در اتصال، تهاجم و سیستمیک شدن این مخمر فرصت طلب دارد. هدف از این مطالعه کلونینگ، بیان و خالص سازی آنزیم sap2 کاندیدا آلبیکنس در مخمر متیلوتروفیک پیکیا پاستوریس بود. پس از آن اثر آنزیم فعال نوترکیب بر فعالیت ماکروفاژهای موش balb/c در بلع بلاستوکنیدیهای کاندیدا آلبیکنس و همچنین آزاد سازی no بررسی شد. در این تحقیق، پس از تکثیر ژنsap2 توسط pcr، محصول درون وکتور بیانی pgapzαa کلون و به درون مخمر پیکیا پاستوریس ترانسفورم گردید. ژن sap2 طی پدیده نوترکیبی همولوگ درون ژنوم مخمر قرار گرفت. پروتئین نوترکیب بیان شده با کمک ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی ni-nta تخلیص و توسط وسترن بلاتینگ با استفاده از مونوکلونال آنتی بادی اختصاصی تائید شد. در مرحله بعد، پروتئین نوترکیب در شرایط in-vitro در مجاورت ماکروفاژهای موش قرار داده شد. برای بررسی فعالیت بلع، سوپرناتانت حاصل از لیز ماکروفاژها، روی محیط scc برده و با شمارش کلنی ها میزان بلع ماکروفاژها بررسی گردید. در سنجش نیتریت اکساید از واکنش رنگ سنجی گریس استفاده شد. در این تحقیق بالاترین بیان، پس از مدت زمان 96 ساعت در دمای cº 30 به دست آمد. نتایج همچنین نشان داد که آنزیم sap2 باعث تضعیف ماکروفاژها می شود. این سلولها، میزان بلع و تولید no کمتری در مقایسه با گروه بدون آنزیم ( کنترل منفی) داشتند. کلونینگ ژن sap2 درون مخمر پیکیا پاستوریسبر خلاف سیستم باکتریایی، منجر به افزایش قدرت بیان انبوه این ژن می شود. همچنین نیاز به تغیرات بعد از ترجمه نداشته و آنزیم تولیدی خود فعال می باشد.sap2 می تواند بلع و تولید مواد انفجار تنفسی مانند no را مهار نماید.