افزایش کارایی متالوپروتئاز وابسته به روی(svp) در حضور حلال های آلی با استفاده از روش جهش زایی هدفمند

حلال های آلی با کندن مولکول های آب از سطح پروتئین باعث تخریب نیروهای غیر کووالان و کاهش فعالیت و پایداری آنزیم می شوند. این آنزیم از یک باکتری هالوفیل ایرانی که از دریاچه نمک جداسازی شده است، بدست آمده است. بر اساس نتایج تکامل جهت دار و کریستالوگرافی در حضور حلال های آلی، جهش یافته های a195e و g203d برای افزایش قطبیت در نزدیکی جایگاه فعال طراحی شدند تا به حفظ لایه آب پوشی در این منطقه در برابر حلال های آلی dmf، متانول، ایزوپروپانول و پروپانول کمک کنند. a268p نیز برای پایدار سازی لوپ اطراف جایگاه فعال طراحی شد. جهش یافته a195e/a268p نیز برای بررسی این دو راهکار با هم طراحی گردید. نتایج نشان دادند که مقدار c50 (غلظتی از حلال آلی که در آن غلظت مقدار فعالیت آنزیمی به نصف کاهش یافته باشد) جهش یافته a195e به میزان 5 و 6 درصد در حضور حلال آلی dmf و متانول افزایش می یابد در حالی که در حضور ایزوپروپانول و پروپانول به میزان 3 درصد افزایش می یابد. شیب غیر فعال شدن دمایی برایa195e حدود (×10-3 min-1) 60 و 130در حضور dmf و پروپانول گزارش می شود، در حالی که شیب غیر فعال شدن در همین شرایط حدود(×10-3 min-1) 90 و 190 می باشد. جهش یافته های a268p و a195e/a268p شیب غیر فعال شدن دمایی آنزیم را به میزان قابل توجهی کاهش می دهند. از طرف دیگر کرامبین به عنوان پایدارترین پروتئین شناخنه شده در حلال های آلی و pst-01 نیز به عنوان کاراترین پروتئاز در حلال های آلی مطرح هستند. آنالیز آماری رزیدوهای سطحی کرامبین ما را به این نکته رهنمون ساخت که تعداد رزیدوهای هیدروفوب در بیرونی ترین سطح این پروتئین بیشتر از رزیدوهای قطبی و بار دار است. با توجه به این یافته ها، رزیدوهای قطبی و باردار بیرونی ترین لایه پروتئین svp با رزیدوهای هیدروفوب تر جایگزین شدند. برای تعیین نوع جایگزینی نیز از رزیدوهای هیدروفوب لایه های بیرونی این دو پروتئین مقاوم و کارا در حضور حلال های آلی (کرامبین و pst-01) استفاده شد. نتایج نشان دادند که حضور رزیدوی هیدروفوب در سطح پروتئین می تواند فعالیت، پایداری و کارایی کاتالیتیک آنزیم را در حضور حلال آلی افزایش دهد. در مقایسه با svp، جهش یافته های n248g، s134y و y23v، kcat و کارایی کاتالیتیک آنزیم را به میزان قابل توجهی افزایش داده و سرعت غیر فعال شدن دمایی آنزیم را نیز کاهش داده اند. این در حالی است که مطالعات ساختاری نشان می دهد این جهش یافته ها تغییرات ساختاری ایجاد نمی کنند. این نتایج آشکار می سازد که با افزایش هیدروفوبیسیته سطحی کارایی کاتالیتیک آنزیم با قدرت هیدروفوبیسیته حلال رابطه مستقیم دارد.