جداسازی وشناسایی یک سویه بومی میکروبی مناسب مولد آنزیم های آمیلولتیک از پساب های صنعتی ایران

آنزیم های آمیلولیتیک به طور گسترده در صنایع نشاسته، شیرین سازی، پودرهای شوینده، کاغذ، نانوایی، نساجی و آبجوسازی مورد استفاده قرار می گیرند. سویه های میکروبی که توانایی تولید این گونه آنزیم ها را دارند، در صنعت بیوتکنولوژی از اهمیت فراوانی برخوردارند. به دلیل پیچیدگی ساختار نشاسته و پلی ساکاریدهای مرتبط، میکروب هایی که این گونه سوبستراها را به عنوان منابع انرژی و کربنی مورد استفاده قرار می دهند، معمولا ترکیب مناسبی از انواع آنزیم های تجزیه کننده نشاسته را دارند. هر یک از آنزیم های آمیلولیتیک با ویژگی های متفاوت که عمدتا خارج سلولی هستند، سهمی در تجزیه نشاسته و پلی ساکاریدهای مرتبط دارند. آلفاآمیلاز، پلولانازها، گلوکوآمیلاز و آلفاگلوکوزیداز از جمله این آنزیم ها می باشند. هدف از این پایان نامه، جداسازی انواعی از سویه های میکروبی با قابلیت تولید مقادیر بالایی از آنزیمهای آمیلولیتیک از مناطق صنعتی، شناسایی سویه ها با آزمایش های مرفولوژیکی و بیوشیمیایی و روش های مولکولی، انتخاب سویه های مناسب و بررسی پروفایل آنزیمی آنها، انتخاب محیط کشت مناسب و تعیین ویژگی های اولیه آنزیم ها بود. اکثر جدایه های باکتریایی از سه ناحیه صنعتی (کارخانجات آرد، گلوتن و آبجوسازی) دارای اشکال میله ای مانند، گرم مثبت و اسپوردار بودند که این مشخصات ظاهری با جنس باسیلوس مطابقت داشت. همه جدایه های قارچی نیز از دو جنس آسپرژیلوس و پنی سیلیوم بودند. با انجام روش غربال گری که اولین بار در این تحقیق استفاده شد، چهار جدایه باکتریایی و یک جدایه قارچی با فعالیت آمیلولیتیکی بالا بدست آمد. نتیجه قابل توجه در مرحله غربال گری این بود که هیچکدام از جدایه های بدست آمده از کارخانه ماءالشعیر بر روی سوبسترای پولولان فعالیت نداشتند و با توجه به این نتیجه، یافتن جدایه های دارای فعالیت پولولانازی در صنایع مرتبط با جو پیشنهاد نمی شود. بعد از شناسایی مرفولوژیکی و مولکولی، سویه قارچی با نام ( aspergillus oryzae (ard 115و سویه های باکتریایی با اسامی (bacillus amylolequefaciens (beh 111 ، (paenibacillus lautus (mpf 112 ، bacillus licheniformis (glu 113) و (bacillus cereus (mpf 114 در بانک ژن ثبت شدند. به دلیل توانایی بالای سویه قارچی در شکستن نشاسته، تحقیقات بیشتر بر روی این سویه انجام شد. این قارچ دارای دو آنزیم اصلی آمیلولیتیک آلفاآمیلاز و گلوکوآمیلاز بود. یک محیط کشت معدنی مناسب برای تولید آنزیم های آمیلولیتیک برای این قارچ در نظر گرفته شد و به جای منبع کربن آن که قند ساکارز است، از سبوس گندم و نشاسته محلول استفاده شد. افزودن منابع مختلف نیتروژنی از قبیل عصاره مخمر، کازئین هیدرولیزشده و نیترات پتاسیم به این محیط کشت، به ترتیب باعث افزایش 100-90، 70-60 و 40-30 درصد در تولید آنزیم های آمیلولیتیک در این قارچ شد. نتایج روند تولید آنزیم آلفاآمیلاز در این قارچ در هر دو محیط کشت نشان داد که تولید این آنزیم بطور همزمان با جوانه زنی اسپورها رخ می دهد. این پدیده با کروماتوگرافی لایه نازک و عکس میکروسکوپ الکترونی روبشی از اسپورها اثبات شد. دما و ph مناسب برای رشد این قارچ به ترتیب ?c 30 و 6 بود. آنزیم آلفاآمیلاز در محدوده دمایی ?c 60-35 و ph 6-4 و آنزیم دیگر یا گلوکوآمیلاز در محدوده دمایی ?c 60-50 و ph 5.5-4 فعالیت بالایی را نشان دادند.