کلونینگ، توالی یابی و بررسی مدل ساختاری و بیان ژن کاتپسینl1 انگل فاسیولا هپاتیکا و تهیه آنتی بادی ضد این آنتی ژن به منظور تشخیص سرولوژیک فاسیولازیس

فاسیولیازیس از مهم ترین بیماری های مشترک میان انسان ودام می باشد که در اثر ابتلا انسانها و دام ها به گونه های مختلف جنس فاسیولا (f. hepatica, f. gigantica) ایجاد می شود. این بیماری در حالی که در جهان از شیوع بالایی برخوردار است در ایران نیز دارای تاریخچه ای طولانی و قابل توجه است. سازمان بهداشت جهانی تعداد موارد انسانی بیماری را در بیش از پنجاه کشور جهان 4/2-7/1 میلیون و تعداد افراددر معرض خطر ابتلا را حدود 180 میلیون نفر بر آورد نموده است. و این در حالی است که وسیع ترین همه گیری های آن در جهان در سالهای 1368 با حدود ده هزار نفر مبتلا و در سال 1378 با آلودگی بیش از پنج هزار نفر در گیلان رخ داده است. ثبت صدها مورد بیماری انسانی در فواصل این دو اپیدمی و پس از آن نشان می دهد که این استان به یک کانون مهم آندمیک بیماری تبدیل شده است. برای نفوذ به بافت، استقرار، تغذیه، فرار و تعدیل سیستم ایمنی، این انگل آنزیم ترشحی به نام کاتپسین l1 را ترشح می کند که به دلیل اینکه در تمام مراحل آلودگی در میز بان ترشح می شود و ایمونوژن قوی نیز می با شد از طرف سازمان بهداشت جهانی به عنوان مهم ترین آنتی ژن در اهداف تشخیصی معرفی شده است. تشخیص روتین بیماری روئیت میکروسکوپیک تخم انگل در مدفوع می باشد که 3 تا 4 ماه پس از ورود انگل اتفاق می افتد در حالی که دوره کمون بیماری بسیار کوتاهتر است و علائم کلینیکی چند هفته پس از ابتلا ظهور پیدا می کند. بنابراین در دوره حاد بیماری هیچگونه تخمی در بیماران وجود ندارد. از این رو مشاهده آنتی ژنها در گردش خون و کوپروآنتی ژن ها با استفاده از تکنیک الایزا وجود بیماری حاد در انسان را به اثبات می رساند و عدم وجود این آنتی ژن پس از درمان دارویی نشان دهنده موفقیت درمان است. لذا در این تحقیق ژن کاتپسین l1که برای اولین بار در ایران شناسایی و تعیین توالی شده است، پس از سنتزcdna از total rnaاستخراج شده از محلول خام هموژنایز شده انگل در pcrتکثیر یافت. پس از آنالیز های فیلوژنیک و بررسی ساختار مولکولی، بیان پروتئین نوترکیب به منظور تهیه مولکول های آنتی ژنیک جهت تزریق به خرگوش و با استفاده از وکتور بیانی pet21aدر میزبان باکتریایی e. coliسویه bl21a انجام گرفت و بعد از آن پروتئین از محلول خام هموژنایز باکتری استخراج شد. سپس آنتی ژن طی چهار هفته با فاصله چهارده روز به خرگوش تزریق شد. پس از تایید حضور آنتی بادی با روش های دات بلا تینگ و ژل دیفیوژن و تیتراسیون نهایی در الایزای مستقیم، خون گیری نهایی انجام شده و آنتی بادی با روش های peg precipitation و کرو ماتو گرافی استخراج شد. در نهایت بعد از تیتر سنجی و بهینه سازی آزمون الایزای ساندویچی، پایدار سازی آن در بستر آمینی کیتو سان و نانوذرات طلا انجام شد.