بیان سطحی آنزیم کیتیناز رمز شده توسط ژن chis بر روی سطح اسپور باکتری bacillus subtilis و بررسی فعالیت آن

تحقیق حاضر، بیان سطحی1 آنزیم کیتیناز باکتری bacillus pumilus2 بر روی اسپور باکتری bacillus subtilis3را مورد مطالعه قرار داده است. همچنین تاثیر احتمالی این سیستم بیانی بر روی فعالیت آنزیمی در شرایط بهینه مدنظر بوده است. نتایج این پژوهش به دلیل جدید بودن این نوع از سیستم بیان سطحی و نیز بیان یک پروتئین دارای فعالیت (یک آنزیم) حائز اهمیت است. تا کنون موردی مبنی بر استفاده از cotb و cotc(از پروتئین های لایه خارجی اسپور به عنوان حامل)، در بیان سطحی یک پروتئین هترولوگ با نقش آنزیمی گزارش نشده است. ژن کیتیناز کلون شده در یک پلازمید با واکنش زنجیره پلیمرازی (pcr) تکثیر شد و در شاتل وکتور های pkh36، pkh40 و pkh41 کلون گردید. پس از تایید کلونینگ ، وکتورهای نوترکیب، توسط هضم آنزیمی به صورت خطی درآمده و پلازمید خطی شده به باکتری bacillus subtilis منتقل شدند. قطعه ژنی هدف طی فرایند نوترکیبی همولوگ4 در محل ژن آمیلاز، که یک ژن غیر ضروری برای باکتری است، وارد شد. پس از تولید و تخلیص اسپور، بیان پروتئین بر روی سطح اسپور توسط آنتی بادی بر ضد کیتیناز و از طریق آنالیز وسترن بلات تایید شد. به منظور بررسی فعالیت آنزیم بیان شده بر روی سطح اسپور، سنجش آنزیمی به روش میلر انجام گرفت. نتایج حاکی از بیان موفقیت آمیز آنزیم کیتیناز بر روی سطح اسپور بود. به علاوه نتایج حاصل از سنجش آنزیمی نشان دهنده تفاوت محسوس بین شرایط بهینه فعالیت آنزیم آزاد و آنزیم تثبیت شده بر روی اسپور بودند. فعالیت بهینه این آنزیم ها به ترتیب در دمای 45°c و ph6، 35°cوph6 و 45°c وph11 برای کیتیناز متصل به cotb ، cotc و cotg بدست آمد.