معرفی ژنهای مرجع برای تجزیه و تحلیل qrt-pcr در بافت های مختلف برخی از گونه های جنس artemisia

جنس آرتمیزیا شمار زیادی از گیاهان معطر را شامل می شود که مصارف گوناگون داروئی و تغذیه ای دارند و حتی در فضای سبز نیز کاربرد دارند. گونه های مختلف آرتمیزیا دامنه وسیعی از اثرات شامل اثر ضد مالاریایی، فعالیت سیتوتوکسیک، ضد باکتریایی، ضد قارچی و خاصیت آنتی اکسیدانی دارند، که بدلیل وجود سزکوئی ترپن در آنهاست. در دهه های اخیر artemisia annua به خاطر دارا بودن آرتمیزینین که یک لاکتون سز کوئی ترپن است و خاصیت ضد مالاریایی دارد، توجه زیادی را به خود جلب کرده است. میزان تولید آرتمیزینین در گونه های مختلف متفاوت است اخیراً آرتمیزینین برای استفاده در برابر عامل مولد مالاریای مقاوم به داروهای چندگانهplasmodium flasiparum استفاده می شود. متاسفانه تولید آرتمیزینین در گیاه بسیار پایین است و سنتز شیمیایی آن نیز بسیار مشکل و پرهزینه است. در سالهای اخیر کوششهای زیادی در زمینه افزایش بیان ژنها و آنزیمهای دخیل در بیوسنتز آرتمیزینین صورت گرفته است. به جهت بررسی میزان تغییرات بیان ژنهای تولید کننده آرتمیزینین در اثر عوامل یاد شده از واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی در زمان حقیقی استفاده می گردد. این تکنیک حساسیت کافی برای اندازه گیری تعداد کم نسخه های mrna را دارد. در واکنش real time pcr، خطاهای ناشی از تجزیه شدن احتمالی rna، تفاوت غلظتrna در نمونه های مختلف، کارایی واکنشrt-pcr و همچنین خطاهای تکنیکی در مراحل انجام آزمایش ممکن است ایجاد شود. در نتیجه به منظور کنترل این خطاها انتخاب روش دقیقی برای نرمال سازی اهمیت دارد. در میان روشهای متعدد نرمال سازی، استفاده از ژنهای خانه دار به عنوان کنترل کننده های داخلی در آنالیز بیان ژن عمومیت دارد. سطوح بیان این ژن ها باید در بافت یا سلول مورد آزمایش نسبتا ثابت باشد و نباید تغییر معنی داری تحت شرایط آزمایش رخ دهد. اما میزان بیان این ژنهای مرجع در میان بافتها و اندامهای مختلف متفاوت است و برای هر نوع ژنوتیپ و بافتی، باید یک یا چند ژن کنترل کننده داخلی مناسب به دقت انتخاب شود. در مطالعه حاضر ثبات بیان هفت ژن ubq ,ef1? ,18s rrna ,cpr ,pal ,act و rps9 در بافتهای مختلف گونه های a. annua، a. absinthium، a. sieberi، a. dracunculusو artemisia sp بررسی شد. پس ازاستخراج rna از سه بافت برگ، ساقه و ریشه، ساخت cdna انجام گرفت. داده های حاصل از واکنش real time pcr بوسیله نرم افزار norm finder به منظور ارزیابی مناسب بودن ژن های مورد نظر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که در میان بافت های گونه های مختلف آرتمیزیا، ژن rps9 معتبرترین ژن کنترل داخلی است. استفاده از ژن های ترکیبی 18s rrna و ubq بهترین ترکیب برای نرمال سازی ژن ها در میان گونه های آرتمیزیا شناخته شد. این نتایج نشان می دهند که ژن های خانه دار به صورت کاملا متفاوتی در بین گونه های مختلف گیاهی تنظیم می شوند و الگوی بیانی متفاوتی دارند. بنابراین یک ژن مرجع با بیان ثابت در یک موجود ممکن است برای نرمال سازی بیان ژن در دیگر موجودات تحت شرایط آزمایش مناسب نباشد و اعتبارسنجی آن قبل از استفاده ضروری به نظر می رسد. تجزیه و تحلیل این ژنها در میان بافتهای مختلف، باز هم پایداری ژن rps9 را اثبات نمود. همچنین ترکیب ژن های rps9 و 18s rrna در بافت های مختلف گیاهان جنس آرتمیزیا می تواند به کار رود. همچنین اندازه گیری میزان آرتمیزینین چند گونه آرتمیزیای موجود در ایران، که به روش ریز استخراج با فیبر تو خالی انجام گرفت نشان داد آرتمیزینین در برگها بیشتر از ساقه وجود دارد و نیز مقدار این ماده ارزشمند در گونه a. annua از گونه های دیگر بیشتر می باشد.