سنتز و کلونینگ cdnaی فاکتور رشد اندوتلیال عروقی 111 (vegf111)

رگ زایی یک فرآیند زیستی مهم در بسیاری از شرایط فیزیولوژیک و پاتولوژیک است. فاکتورهای رشد اندوتلیال عروقی گروهی از شناخته شده ترین و کلیدی ترین فاکتورهای رشد در فرآیند رگ زایی بوده و در در میان تمام اعضای این خانواده، vegf-a مهم ترین عضو می باشد. در حال حاضر vegfها به طور گسترده ای در جهان توسط تکنیک های مهندسی ژنتیک به صورت نوترکیب تولید شده و در تحقیقات مختلف رگ زایی، سلول های بنیادی، پزشکی ترمیمی و مهندسی کشت بافت مورد مصرف قرار می گیرند. vegf-a به صورت واریانت های مختلفی وجود داشته که حاوی اگزون های متفاوت، ویژگی های برجسته متمایز و الگوهای بیانی اختصاصی می باشند. در بین تمام ایزوفرم های vegf-a، فاکتور جدید 111vegf- با ویژگی رگ زایی قوی و پایداری بسیار بالا از اهمیت ویژه ای در تحقیقات بیولوژی مولکولی برخوردار بوده و به عنوان یک فاکتور درمانی پیشنهاد می شود. رگ زایی ناقص و ایسکمی یکی از مشکلات مهم در پزشکی و در بسیاری از اختلالات شامل بیماری های قلبی – عروقی و جراحت ها می باشد. در این شرایط پاتولوژیک، اگرچه افزایش سطح mrnaی مربوط به vegf-a تشخیص داده می شود، محیط پروتئولیتیک و مخصوصاً سرین پروتئازهایی مانند پلاسمین منجر به تجزیه ی vegf-a و رگ زایی ناقص می شوند. ویژگی رگ زایی قوی در واریانت 111vegf- و مقاومت آن نسبت به فرآیند پروتئولیز، آن را به کاندید جالب و جذاب برای کاربردهای درمانی در بیماری های ایسکمیک تبدیل نموده است. بیان این ایزوفرم ویژه در سلول هایی که در معرض اشعه ی uv-b و داروهای ژنوتوکسیک قرار گرفته اند، القا شده و به طور طبیعی در سلول های نرمال فاقد بیان می باشد. هدف از مطالعهی حاضر، سنتز و کلونینگ cdnaی فاکتور رشد 111vegf- به صورت نوترکیب همراه با افزودن توالی اینترونی به منظور بالا بردن میزان بیان و ترجمه ی این ایزوفرم می باشد. در این راستا، طی واکنش های pcr مجزا قطعات کد کننده اگزون های 4-1 و اینترون 5-4 تکثیر شده و با قرار دادن توالی کد کننده جایگاه شناسایی یکی از آنزیم های نوع iis به نام eco31i در پرایمرهای مورد نظر، این دو قطعه ی به یکدیگر متصل شده و در وکتور pbud.ce4.1 کلون گردیدند. در ادامه، پلاسمید نوترکیب pbud-vegf111 درون باکتری e.coli top10 ترانسفورم شده و پس از تأیید فرآیند کلونینگ درون دو لاین سلولی cho dhfr- و hek 293 ترانسفکت گردید. سپس، بیان ایزوفرم 111vegf- توسط تکنیک real time pcr و در دو لاین سلولی مورد استفاده بررسی شد. در نهایت تولید پروتئین 111vegf- از طریق دو تست دات بلات و الایزا به طور کیفی مورد مطالعه قرار گرفت.