استخراج و غنی سازی الکل دی هیدروژناز از جگر مرغ با بکار گیری میکروحباب ها (aphrons)

بافتهای گیاهی و اندامهای حیوانی از جمله مهمترین منابع آنزیمی در بیوتکنولوژی آنزیم ها هستند. حدود 70% آنزیم ها از این منابع استخراج شده اند و آنزیم هایی که از اندامهای حیوانی بدست می آیند درحدود 10% کل آنزیم های موجود در بازار است. بر این اساس در این پروژه جگر مرغ به عنوان منبع آنزیمی ارزان قیمت، در دسترس و غنی از آنزیم ها، برای جداسازی آنزیم الکل دی هیدروژناز انتخاب شد. احیا و خالص سازی محصولات بیولوژیکی معمولاً با فرآیند های پیچیده ای همراه است که هزینه آن حتی از 70% قیمت نهایی محصول بالاتر است. در سالهای اخیر با تولید پروتئین های جدید در صنعت بیوتکنولوژی ، روشهای جداسازی ساده و ارزان قیمت مورد نیاز است. روند مرسوم خالص سازی پروتئین شامل عملیات چند مرحله ایست که با تلفات قابل ملاحظه ای از فعالیت آنزیم همراه است. روند مورد استفاده در این تحقیق جداسازی ازطریق کف است که ضمن حداقل سازی مراحل فرآیند، بازده خالص سازی را حفظ می کند. در این روش با ایجاد حباب در محلول حاوی مواد فعال سطحی و آنزیم مورد نظر، یک سطح مشترک گاز- مایع ایجاد می شود که مواد فعال جذب سطحی این فصل مشترک می شوند. انتقال پروتئین به فاز کف با کوچک شدن اندازه حبابها، افزایش می یابد و این ناشی از سطح مشترک بیشتر و افزایش غلظت پروتئین جذب شده است. در جداسازی های بیومولکولی، حباب های بسیار کوچک، اصطلاحا" افرون "، ویژگی های استخراجی خوبی را نشان داده اند. بنابراین در این پروژه از میکرو حبابها جهت استخراج و غنی سازی آنزیم مورد نظر استفاده شد. به منظور تولید حباب ، محلول حاوی مواد فعال سطحی به وسیله همزن فراصوت با دور موتور مورد نظر و در زمان مشخص هم زده شد. سپس حجم معینی از حباب ها با محلول حاوی آنزیم مخلوط شد و پس از گذشت زمان مشخصی جداسازی شد. برای بررسی بی تاثیری مواد فعال سطحی بر روی ماهیت آنزیم ، از الکتروفورز استفاده گردید. میزان آنزیم غنی سازی شده نیز با استفاده از روابط و میزان جذب نور در دستگاه uv محاسبه شد. نتایج بدست آمده نشان داد که بسته به نوع و غلظت ماده فعال سطحی، ph و حضور نمک، بازده غنی سازی متفاوت بود. ابتدا آزمایش ها با استفاده 3 نوع ماده فعال سطحی آنیونی و کاتیونی صورت گرفت که در پایان و با توجه به نتایج بهترین ماده فعال سطحی، ماده فعال سطحی آنیونی aot ، انتخاب شد. نمک های مورد استفاده نیز kcl و nacl بودند که آزمایش ها نشان داد در حضور kcl و در غلظت 6 میلی مولار aot و در 6 ph= علاوه بر اینکه می توان حباب های کوچکتری تولید کرد، بالاترین بازده غنی سازی نیز بدست آمد که نسبت به حالت 1/0 میلی مولار aot و در غیاب نمک و در 6 ph=، بازده غنی سازی 4/2 برابر بود. حباب های تولیدی قابل اندازه گیری در حدود 10-100 میکرومتر بود و احتمال ایجاد نانو حباب در حضور نمک kcl وجود داشت که به دلیل در دسترس نبودن وسایل اندازه گیری مناسب، امکان شناسایی نانو حباب ها فراهم نشد. بررسی از طریق الکتروفورز نیز عملکرد غنی سازی و عدم تغییر ماهیت الکل دی هیدروژناز از طریق aot را تایید کرد.