همسانه سازی ژن های الکل دهیدروژناز و پیروات دکربوکسیلاز در باکتری e.coli و بررسی بیان در ضایعات کشاورزی

با توجه به آلودگی زیست محیطی و کاهش منابع فسیلی کشور، در طول یک دهه¬ی اخیر توجه جدی به تولید سوخت-های زیستی و جایگزینی آن با سوخت¬های فسیلی شده است. با توجه به این مساله که تولید این سوخت¬ها توسط موجودات زنده میکروبی انجام می¬گیرد، بخشی مهمی از تحقیقات به انتخاب میکروارگانیسم¬های برتر جهت تولید و افزایش توان تولیدی آن¬ها اختصاص یافته است. در این تحقیق ابتدا ژن¬های پیروات دکربوکسیلاز (pdc) و الکل دهیدروژناز (adh) از باکتری zymomonas mobilis به دلیل این که کلیدی¬ترین آنزیم¬ها در مسیر تولید اتانول زیستی می¬باشند انتخاب و در باکتری e. coli همسانه سازی گردیدند. جهت همسانه سازی این ژن¬ها از پرایمرهای اختصاصی ژن¬های پیروات دکربوکسیلاز و الکل دهیدروژناز و طی واکنش pcr ژن¬های مورد نظر جداسازی و در مرحله بعدی ژن¬های adh و pdc و پلاسمید pet 28a توسط آنزیم¬های محدود کننده sal i و xho i برش یافتند. سپس محصولات برش یافته توسط آنزیم لیگاز در دمای 16 درجه سانتی¬گراد و در مدت 16 ساعت به همدیگر متصل شدند. در نهایت پلاسمیدهای نوترکیب به باکتری¬های شایسته e. coli با استفاده از روش ذوب-انجماد منتقل گردیدند. جهت تایید باکتری¬های نوترکیب e. coli از چهار آزمون استفاده شد که اولین آزمون شامل کشت کلونی¬ها در محیط کشت lb (حاوی کانامایسین به میزان mg۵۰) بود. نتایج کشت باکتری¬های تراریخت بر روی محیط حاوی کانامایسین نشان داد که تنها کلونی¬های محدودی قادر به رشد می¬باشند که حاوی پلاسمید pet می¬باشند. در مرحله بعدی نتایج colony pcr با پرایمرهای اختصاصی ژن¬ها نشان دادند که باندهای مربوط به ژن¬های pdc و adh با اندازه 1700 و 1150 جفت باز قابل مشاهده می¬باشند. نتایج مربوط به pcr پلاسمیدهای نوترکیب توسط آغازگر رفت پروموتور t7 و آغازگرهای برگشت ژن¬های pdc و adh، جهت صحیح درج ژن¬ها در داخل پلاسمید را ثابت و باندی به اندازه 1885 و 1335 را در الکتروفورز ژل آگارز ۱% را نشان داد و در نهایت نتایج هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب توسط آنزیم¬های sal i و xho i باندهای مشابهی را آشکار کرد.