تأثیر کاهش دما، منابع غذایی و هورمونی بر تکوین اندام های زایشی انگور در شرایط درون شیشه ای

رشد گل آذین و تولید میوه در محیط درون شیشه¬ای می¬تواند ابزار ارزشمندی را در اختیار ما برای تحقیق و بررسی¬های دقیق مراحل مختلف فرایند های فیزیولژیکی مربوط به تکوین اندام های زایشی و مراحل حساس در این دوره قرار دهد. در این پژوهش گل آذین در حال رشد از دو رقم انگور شامل، بیدانه سفید و روبی سیدلس از شاخه¬های جوان و در حال رشد طبیعی بهاره جدا شدند. برای کشت درون شیشه ای گل¬آذین¬ها از محیط کشت پایه ms با نصف غلظت استفاده شد. پس از کشت، رشد و نمو گل آذین¬ها تا تشکیل میوه و سپس رسیدن حبه¬ها ادامه داشت. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با فاکتور رقم در دو سطح و جیبرلین در 2 سطح (صفر و 89/2 میکرومولار)، بنزیل آمینوپورین در 3 سطح (صفر، غلظت های 5/2 و 4 میکرومولار) و هورمون ایندول بوتیریک اسید در 3 سطح (صفر، غلظت ¬های 5/2 و 9 /4 میکرومولار) با سه تکرار در هر تیمار انجام شد. نوع هورمون و غلظت آن در موفقیت رشد گل¬آذین¬های کشت شده موثر بود، به طوری که در تیمار ایندول بوتیریک اسید با غلظت 9/4 و بنزیل آمینو پورین با غلظت 4 میکرومولار و بدون حضور جیبرلین، گل¬آذین کشت شده رشد کرد و گل¬ها باز شدند و نهایتاً تولید میوه کردند (محیط کشت 15 و 17). در اینجا نقش هورمون اکسین و سیتوکنین به عنوان هورمون¬های کلیدی در باز شدن و تولید میوه در انگور مشخص در حالی که نقش جیبرلین ناچیز بود. در مقایسه بین ارقام، ریز نمونه¬های رقم بیدانه سفید نسبت به روبی سیدلس از لحاظ ماندگاری و طول دوره رشد، سازگاری بهتری را به شرایط درون شیشه¬ای نشان دادند. در تیمار شاهد بدون هورمون گلهای روی گل¬آذین قهوه¬ای و بعضاً شیشه ای شده و از رشد بازایستادند. در مرحله بعدی پژوهش برای بررسی اثر تأثیر کاهش دما، منابع غذایی و هورمونی بر تکوین اندام های زایشی انگور در شرایط درون شیشه ای ابتدا بررسی ساختار تکوینی دو رقم انگور مورد آزمایش در شرایط طبیعی انجام گرفت تا اطلاعات اولیه از وضعیت طبیعی ساختار تکوینی گل آذین¬ها در اختیار قرار گیرد. در این رابطه، غنچه¬های باز نشده از گل آذین¬های تشکیل شده بر روی شاخه¬های یکساله هر دو رقم از پایه¬های رشد یافته در شرایط طبیعی جمع آوری شد. نمونه¬ها در فیکساتورfaa 70 تثبیت و در الکل70 %در محیط خنک (یخچال) نگهداری شدند. سپس نمونه¬های جمع آوری شده، پس از قالب گیری در پارافین با میکروتوم برش داده شدند و رنگ آمیزی با هماتوکسیلین و ائوزین انجام گرفت. سپس نمونه¬ها بر روی لام شیشه¬ای قرار داده شدند و با میکروسکوپ نوری مورد بررسی و عکس برداری قرار گرفتند. نتایج حاصل از این بررسی نشان داد که بساک این گل¬ها از نوع چهار کیسه¬ای و دیواره بساک از نوع دولپه¬ای و از یک لایه اپیدرم، لایه مکانیکی و لایه تغذیه کننده تشکیل شده است. دانه گرده در زمان انتشار دارای سه شیار طولی می¬باشد. هر گل دارای 5 کاسبرگ، 5 گلبرگ به هم پیوسته و مادگی با تخمدان دو برچه و در هرخانه تخمک¬ها واژگون و با تمکن محوری هستند و پارانشیم خورش به مقدار زیاد دیده می¬شود. تقسیمات سلول مادر مگاسپور به صورت عرضی و طولی دیده شد که منجر به تتراد¬های کروی و چند ضلعی می¬شود. در نهایت لقاح با سلول تخم¬زا در کیسه رویانی منجر به رویان گویچه ای شد. در آزمایش بعدی با استفاده از نتایج بدست آمده از آزمایش قبل، از بهترین محیط کشت شناخته شده برای کشت گل آذین استفاده شد تا ریز نمونه¬های مورد نیاز برای تیمار سرما دهی یا دمای پایین کشت و آماده گردد. بدین منظور و برای بررسی اثر تنش دمای پایین بر مراحل تکوین اندام¬های زایشی و نیز تیمارهای کاهنده اثرات تنش دمای پایین، تعداد مورد نیاز از گل آذین¬های هردو رقم در محیط درون شیشه¬ای کشت شدند. پس از رشد و نمو گل ¬ها، برای تعیین بخش حساس گل به سرما و ارزیابی¬های لازم، گل آذین-های درون شیشه، از هر دو رقم، قبل از باز شدن، تحت دو تیمار دمایی شامل دماهای 17/14 و 12/9 سلسیوس، به ترتیب برای روز و شب (16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی) برای سه شب قرار گرفتند. پس از این مرحله نمونه¬ها به دمای20/ 25 درجه انتقال داده شدند تا تعدادی از نمونه گل¬ها به رشد خود ادامه داده و بطور طبیعی شکوفا شوند. قبل از باز شدن گل¬ها، نمونه¬های تیمار¬های مختلف جمع آوری شده و پس از آماده سازی به روش سیتو هیستولوژیک با میکروتوم برش گیری و پس از رنگ آمیزی مورد بررسی میکروسکوپی قرار گرفتند. نتایج حاصل از تیمار¬های دمایی نشان داد که رقم روبی سیدلس به سرما حساس¬تر بوده و ضمن تأثیر پذیری منفی از قرار گرفتن در دمای17/14، در شرایط دمای12/9 درجه سلسیوس حساسیت بیشتری نشان داد. دوره باز شدن گل¬ها طولانی تر و تقریباً تمایل به رنگ قهوه¬ای نشان داده شد. در حالیکه در مقایسه، رقم بیدانه به دمای17/14 درجه حساسیت بسیار کمتری نشان دادند و به دمای12/9 درجه تحمل بیشتری داشتند. مطالعات میکروسکوپی نشان داد که نمونه¬های گل سرما دیده، اغلب فاقد بذر در حجره¬های تخمدان بوده، کیسه جنینی تشکیل نشده و یا تجزیه کیسه جنینی اتفاق افتاده است. سایر مشاهداتی که در نمونه¬های آسیب دیده از تنش سرما قابل تشخیص بود عبارت بودند از: کریستالی شدن تخمدان، نقص در ساختار تخمک یا پوک شدن بذر و یا کاهش پارانشیم خورش، رشد نابرابر یا بیشتر پوسته¬های تخمک، چند شکلی شدن دانه¬های گرده و یا فاقد دانه گرده بودن در بساک، دانه¬های تتراد بهم چسبیده و غیر قابل جدا شدن، رشد غیر طبیعی بساک طوری که لایه¬های مختلف تشکیل دهنده آن آثار تخریب و بی نظمی را نشان می¬دهند، عدم تشکیل رویان و کاهش درصد باز شدن گل و درصد جوانه زنی گرده. تمامی ناهنجاری¬های ایجاد شده در اثر تنش دمای پایین، موجب عدم موفقیت گل¬ها در گرده افشانی، تلقیح و تشکیل میوه می¬گردند. در ادامه این تحقیق، با هدف بررسی نقش تیمارهای هورمونی و تغذیه¬ای بر کاهش آثار منفی تنش دمای پایین ، تیمار اسید سالیسیلیک با غلظت¬های 5 ،10 میکرو مولار و سیتوکینین با غلظت¬های 2و4 میکرو مولار و تیمار منابع غذایی شامل بُر به میزان 62/0، 75/0 گرم در لیتر به صورت اسید بوریک و قند ساکارز به مقدار 15 و20 درصد به محیط کشت بهینه گل آذین (15) اضافه شدند. آزمایش به صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملا تصادفی بر روی دو رقم بیدانه سفید و روبی سیدلس در تحت تیمار سرمایی در شرایط دمای12/9 درجه سلسیوس و با اعمال 5 تیمار مختلف انجام شد. با توجه به نتایج حاصل از این آزمایش، رقم بیدانه سفید با درصد بیشتری از تشکیل گل¬های کامل، نسبت به رقم روبی سیدلس عکس العمل بهتری به تیمار¬های مورد استفاده نشان داد. اثر متقابل رقم و تیمار¬های مورد استفاده نشان داد که ساکارز با هردو غلظت 15و 20 گرم در لیتر و بُر با غلظت 75/0 میلی گرم در لیتر باعث افزایش درصد تشکیل گل¬های سالم در رقم بیدانه سفید شدند. همچنین غلظت 75/0 میلی گرم در لیتر اسید بوریک وغلظت¬های 15 و20 گرم در لیتر ساکارز و 10 میکرومولار اسید سالیسیلک در رده بعدی در افزایش میزان باز شدن و تشکیل گل طبیعی سالم در رقم روبی سیدلس شدند. افزایش میزان کربوهیدرات های محلول، پروتئین¬های محلول و پرولین با تشکیل گل¬های سالم رابطه مستقیم داشته و در حفظ و بقاء بخش¬ها و اجزای حساس گل¬ها نقش موثری داشتد. در مجموع می توان چنین نتیجه گیری کرد که بالاترین غلظت تیمار¬های مورد استفاده در این آزمایش اثر مثبتی بر افزایش متابولیت¬های ضروری داشته و با تقویت مکانیزم¬های مقاومت به تنش سرما در بافت¬ها و اندام¬های جوان و ظریف گل از صدمات ناشی از دمای پایین جلوگیری کرده¬اند.