افزایش کارایی آنزیم تایروزیناز از طریق تثبیت آن بر روی فاز جامد

در این پایان نامه، مطالعه ای کامل بر روی کارایی آنزیم تایروزیناز پس از تثبیت در ژل پلی آکریل آمید در محیط های بافر فسفات و مخلوط بافر فسفات با حلالهای آلی (استونیتریل، ایزوپروپانل، متانول و تتراهیدروفوران) صورت گرفته است. بهمین منظور ابتدا تخلیص آنزیم تایروزیناز از قارچ خوراکی که منبعی ارزان و قابل دسترس می باشد صورت گرفت. در این راستا، اثر بافرهای مختلف بر روی میزان استخراج آنزیم از قارچ خوراکی و نیز اثر حلالهای آلی در حذف ترکیبات مزاحم از عصاره پروتئینی بررسی شد. همچنین میزان خلوص نسبی رسوب حاصل از محلول عصاره پروتئینی بوسیله درصدهای مختلف اشباع نمک سولفات آمونیوم مورد بررسی قرار گرفت. در این تحقیق جهت بدست آوردن خلوص بالاتری از آنزیم، از ستون تعویض آنیونی نیز استفاده شد و در نهایت از آنزیم تخلیص شده ژل الکتروفورز گذاشته و فعالیت کرزولاز و کتکولاز آنزیم نیز سنجیده شد. پس از بدست آوردن خلوص نسبی آنزیم در رسوب حاصل از غلظت 55 درصد اشباع نمک سولفات آمونیوم، مرحله تثبیت آنزیم در ژل انجام شد. ابتدا جهت بررسی شرایط تثبیت، آلبومین سرم گاوی ( bsa) در ژل آکریل آمید تثبیت شد و در مخلوط حلالهای ذکر شده و بافر فسفات با درصدهای 0، 25، 50، 75 و 100 نگهداری شد و پس از 20 و 144 ساعت، میزان خروج پروتئین از ژل بوسیله دستگاه اسپکتروفتومتر و در 280 nm سنجیده شد. استونیتریل و ایزوپروپانل با درصدهای مختلف جهت سنجش کارایی ژل در حفظ آنزیم انتخاب شدند. آنزیم تایروزیناز در ژل محبوس شد و در همان مخلوط حلالها نگهداری شد و در زمانهای 24 و 144 ساعت میزان خروج آنزیم در 280nm اندازه گیری گردید. درصدهای مختلف استونیتریل و ایزوپروپانیل به عنوان محیطهای نگهداری ژل و سنجش فعالیت کروزولاز آنزیم تثبیت شده با استفاده از سوبسترای متیل فنل مورد استفاده قرار گرفتند. سنجش فعالیت کروزولاز آنزیم محبوس شده در ژل در زمانهای 0،48،96 و 144 ساعت در مورد ژلهایی که در مخلوط حلال نگهداری شده بودند، انجام شد. همچنین سنجش فعالیت کروزولاز آنزیم محبوس شده در ژل، در استفاده های مکرر در زمانهای 144, 96, 48, 0 و 192 ساعت انجام شد. در مرحله بعد جهت بدست آوردن km و vmax سوبسترای فنلی در مورد آنزیم تثبیت شده در محیط استونیتریل با درصدهای 50 و 75، غلظتهای مختلف از سوبسترا از 3*10به توان منفی 5m تا 2*10 به توان منفی 4m مورد آزمایش قرار گرفت و km و vmax از روش لاین ویور برک بدست آمد. در نهایت سنجش میزان تولید ال دوپا توسط آنزیم تثبیت شده در محیط 75 درصد استونیتریل مورد مطالعه قرار گرفت. لازم به ذکر است که هر آزمایش حداقل سه بار تکرار شده است. نتیجه آنکه محیط حاوی 75 درصد استونیتریل و 25 درصد بافر فسفات توانست در حفظ فعالیت کروزولاز آنزیم بسیار موثر باشد. به نوعی که افت فعالیت پس از 4 بار استفاده مجدد به فواصل 48 ساعت 14 درصد بوده است. همچنین با محاسبه پارامترهای سینتیکی مشاهده شد که سرعت انجام واکنش با آنزیم محلول تفاوتی ندارد ولی میزان تمایل آنزیم تثبیت شده که در محیط حلالی فوق قرار گرفته است نسبت به سوبسترا کاهش پیدا کرده است. همچنین میزان تولید ال-دوپا از آنزیم تثبیت شده در این تحقیق 21/4 umol/min می باشد.