بهینه سازی مولکولی ژن کیتیناز 42 و انتقال آن به قارچ trichoderma harzianum جهت افزایش توان ضد قارچی و فعالیت کیتینازی آن

در این تحقیق به منظور افزایش میزان فعالیت بیوکنترلی قارچ t. harzianum بعنوان یکی از مهمترین عوامل آنتاگونیست بیمارگر های گیاهی، مهندسی پروتئین آنزیم کیتیناز 42 انجام شد. در راستای افزایش فعالیت کیتینازی آنزیم کیتیناز 42 بر روی ساختارهای کیتین تشکیل دهنده دیواره سلولی قارچ ها سه راه کار اصلی به کار گرفته شد. روش اول افزایش تعداد ژن کیتیناز 42 در قارچ t. harzianum بود. در روش دوم chbd آنزیم کیتیناز 18-10 از قارچ t. atrovirideجداسازی شد و توسط لینکر به انتهای آمینی کیتیناز42 بعد از ناحیه سیگنال پپتید اضافه شد و کیتیناز کایمر حاصل به قارچ t. harzianumانتقال یافت. در روش سوم chbd آنزیم کیتیناز chi1 از قارچ r. oligosporus گرفته شد و با لینکر به انتهای کربوکسیلی کیتیناز42 افزوده شد و سپس به قارچ t. harzianum انتقال یافت. پس از مطالعات بیوانفورماتیکی و بررسی اثر افزودن chbd روی ساختار دوم و سوم آنزیم های کایمری حاصل، ساختار های ژنی دو بخش کیتیناز42 و chbd تکثیر و به کمک soeing pcr به هم متصل شدند. صحت ساخت ژن های کایمری نوترکیب با روش های مولکولی تایید و سپس توالی یابی شدند. سپس ژن های کیتینازکایمری و کیتیناز42 در سازه بیانی همسانه سازی شدند. شرایط بهینه برای تولید پروتوپلاست (/ml108×5) بعنوان سلول های مستعد دریافت ژن مورد مطالعه قرار گرفت که، عبارت بود از استفاده از ریسه های 5 روزه، سن 24 ساعت برای سوسپانسیون کنیدیایی، بکارگیری آنزیم با غلظت mg/ml 6/6 در دمای °c30 و زمان دو ساعت برای انکوبه شدن در محلول آنزیمی. بهترین شرایط انتقال هم زمان دو ژن به پروتوپلاست ها هنگامی بود که ?l 16(?g 10dna) از هر ناقل با?l 330 پروتوپلاست مخلوط گردید. سپس ژن های کیتیناز کایمری(chit42-chbd و chit42rchbd) و کیتیناز42 پس از همسانه سازی در ناقل بیانی، به پروتوپلاست های قارچt. harzianum منتقل شدند. بیان ژن های مورد نظر پس از تائید مولکولی، بوسیله real time rt-pcr بررسی شد. فعالیت آنزیمی برای جدایه های تراریختی که ژن کیتیناز کایمر (chit42-chbd) را دریافت کرده بودند u/ml 86/1 تا u/ml2/6 و برای جدایه های تراریخت با کیتیناز42، بین u/ml 16/1 تا u/ml 15/3 بود. میزان میانگین بازدارندگی هفت بیمارگر مهم گیاهی، بوسیله جدایه های تراریخت chit42-chbd بین 6/31 تا 6/88 درصد بود که در مقایسه با نمونه غیر تراریخت، کنترل (5/49-10درصد) و جدایه های تراریخت با ژن کیتیناز42 (4/63-7/24 درصد) اختلاف چشمگیری نشان داد. جدایه chit42-chbd15 بیشترین میزان بازدارندگی در برابر هفت بیمارگر را از خود نشان داد. همچنین فعالیت آنزیمی جدایه های تراریختی که دومین ژن کیتیناز کایمر(chit42rchbd) را دریافت کرده بودند u/ml 76/1 تا u/ml1/4 و برای جدایه های تراریخت با کیتیناز42، u/ml 16/1 تا u/ml 01/3 بود. میزان میانگین بازدارندگی هفت بیمارگر گیاهی، بوسیله جدایه های تراریخت chit42rchbd بین 7/30 تا 7/69 درصد بود که در مقایسه با نمونه غیر تراریخت، کنترل (49-12درصد) و جدایه های تراریخت با ژن کیتیناز42 (5/62-24 درصد) اختلاف نشان داد. در این گروه، جدایه chit42rchbd3 بیشترین میزان بازدارندگی در برابر هفت بیمارگر را از خود نشان داد. مجموع یافته ها نشان داد که جدایه chit42-chbd15 دارای بیشترین توان بیوکنترلی در بین کلیه جدایه ها است. حفظ توان بیوکنترلی جدایه ها توسط میکروسکوپ الکترونی نیز مورد بررسی و تائید قرار گرفت. یافته های این تحقیق نشان داد که بیان ژن های کیتیناز کایمر در قارچ t. harzianum سبب افزایش توان بیوکنترلی آن شده و جدایه های تریکودرما حاصل می توانند بعنوان بیوکنترل در برابر بیمارگر های مهم کشاورزی مورد استفاده قرارگیرند.