در این مطالعه، بر اساس منطقه 16s rdna باکتری شکمبه ای هضم کننده سلولز، بوتیریویبریو فیبری سالونس، یک روش واکنش زنجیره ای پلیمراز رقابتی (cpcr) بهینه سازی شد. آغازگرهای اختصاصی این باکتری برای تکثیر یک قطعه 213 جفت نوکلئوتیدی از ناحیه 16s rdna (dna هدف) از منابع انتخاب گردید. برای تولید قطعه رقابتگر همولوگ با قطعه هدف، دو آغازگر داخلی، که هر کدام حامل حدود 30 نوکلئوتید در انتهای ?5 خود بودند (به صورتی که بتوانند تکثیر شوند و مکمل یکدیگر باشند) طراحی شدند و یک واکنش soe-pcr شامل سه واکنش مجزای pcr با استفاده از جفت آغازگرهای متفاوت انجام شد. قطعه حاصل از این واکنش ها در نهایت علاوه بر توالی نوکلئوتیدی قطعه هدف دارای 50 نوکلئوتید بیشتر می باشد. جهت افزایش بیشتر صحت pcr رقابتی و همچنین استفاده های آتی از این قطعه و سهولت تعیین دقیق تعداد نسخه های آن این قطعه در داخل یک ناقل پلاسمیدی (ta) و با استفاده از باکتری e. coli به عنوان میزبان، همسانه سازی شد و صحت توالی همسانه سازی شده بوسیله هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب مورد تأیید قرار گرفت. واکنش pcr رقابتی با استفاده از مقادیر مشخصی از dna پلاسمیدی به عنوان رقابتگر بهینه سازی شد و نتایج به دست آمده با استفاده از نرم افزار image j تجزیه و تحلیل شدند. نتایج نشان دادند روش استفاده شده به خوبی قابلیت تشخیص و تعیین کمی مقادیر باکتری بوتیریویبریو فیبری سالونس را در نمونه های گرفته شده از شکمبه را دارا می باشد.

چکیده میوستاتین کنترل کننده منفی رشد عضله است. جهش¬های طبیعی که در ژن کد کننده آن در طول تکامل نژادها رخ داده است، رابطه معنی¬داری را با حجم و رشد عضله نشان می¬دهند. این جهش¬ها به دو صورت، تخریب ژن میوستاتین و یا کاهش سطح رونوشت آن، موجب ایجاد فنوتیپ "عضله مضاعف" در برخی نژادهای گاو، گوسفند و سگ می¬شوند. این یافته¬ها این فرضیه را تقویت می¬کنند که با استفاده از تکنیک¬های زیست فن¬آوری برای تخریب ژن میوستاتین، می¬توان فنوتیپ عضله مضاعف را دیگر نژادهای حیوانات مزرعه¬ای و از جمله نژادهای بومی کشور ایجاد نمود. اهداف اصلی این مطالعه عبارت بودند از: الف) توسعه روشی برای مهندسی تالن¬ها ب) ساخت یک جفت تالن برای تخریب ژن میوستاتین در گوسفند، گاو و بز و ج) تست فعالیت تالن¬های ساخته شده در سلول¬های بنیادی جنینی موشی. به این منظور روش golden-gate cloning برای ساخت تالن¬ها با اعمال تغییراتی در پروتکل آن بهینه¬سازی شد. همچنین دو ناقل پلاسمیدی جدید حاوی رنگ¬های فلورسنت mcherry و egfp جهت کلون نمودن منطقه کد کننده تالن¬ها ساخته شدند. با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیک منطقه¬ای در اگزون دوم ژن میوستاتین برای هدف¬گیری بوسیله تالن¬ها انتخاب گردید. این ناحیه در گوسفند، بز، گاو، خوک و موش کاملاً یکسان بود. سه جفت تالن در پلاسمیدهای متفاوت جهت هدف¬گیری این منطقه خریداری و یا بوسیله روش مذکور ساخته شد. فعالیت تالن¬هایی که برای هدف¬گیری این منطقه طراحی و ساخته شده بودند در سلول¬های بنیادی جنینی موشی مورد بررسی قرار گرفت. کلونی¬های سلولی بوسیله تکنیک high resoloution melting (hrm) جهت تشخیص جهش¬های القا شده بوسیله تالن¬ها در منطقه هدف غربالگری شدند. نتایج نشان دادند که تالن¬های مهندسی شده برای هدف¬گیری اگزون دوم میوستاتین قابلیت القای موتاسیون با کارایی بین 5 الی 35 درصدی را دارا هستند. جهت تایید این نتایج، سه کلونی که بوسیله hrm جهش یافته تشخیص داده شده بودند برای منطقه هدف توالی¬یابی شدند. به این وسیله، سه آلل حاوی جهش که هر کدام به ترتیب حاوی 7، 11 و 22 جفت باز حذف شده در منطقه هدف بودند شناسایی شدند. نتایج این مطالعه قابل تعمیم به دیگر نژادها هم هستند و لذا کارایی بالای تالن¬ها این امکان را فراهم می¬آورد تا محدودیت¬های تکنیکی برای تولید حیوانات تراریخت مزرعه¬ای به نحو بسیار چشمگیری کاهش یابد. کلیدواژه¬ها: میوستاتین، تالن، جهش زایی، هدف¬گیری ژن¬ها.