حشره های شب تاب با تولید پروتئین منتشر کننده ی نور -که لوسیفراز نامیده می شود، با یک دیگر رابطه برقرار می کنند. لوسیفرازها آنزیم هایی هستند که برای انتشار نور از سوبسترایی به نام لوسیفرین همراه با atp وmg2+ و اکسیژن مولکولی برای انتشار نورهایی با رنگ های متنوع استفاده می نمایند. بسته به فاکتورهای متفاوت -که یکی از مهمترین آن ها اسیدآمینه های تشکیل دهنده ی لوسیفراز است- نورهایی با طیف رنگی متفاوت از لوسیفرازها منتشر می شود. لوسیفراز حشره ی شب تاب گونه ی ایرانی با نام علمی lampyris turkestanicus - که در جنگل های شمال ایران زندگی می کند- نور سبز منتشر می کند. در این کار برای اولین بار کریستال لوسیفراز جهش یافته گونه ی ایرانی lampyris turkestanicus -که نور قرمز ساطع می کند- به منظور مطالعه و تعیین ساختار سه بعدی با روش کریستالوگرافی اشعه ی x تهیه شد وکریستالی با حدتفکیک 2/2 آنگستروم با r-factor=0.17 وبا تقارن تتراگونال به دست آمد. آنالیز اطلاعات نقشه ی چگالی الکترون، بیان گرتطابق بالای دم انتهای آمینی با مدل (pdb code: 1ba3) بود. لوپ 359-351 که جهش در آن صورت گرفته است در نقشه ی چگالی الکترون وجود دارد. در حالیکه چگالی الکترون دم انتهای کربوکسی بسیار ضعیف است و تطابقی بین چگالی الکترون آن و مدل حاصل نشد. این می تواند یا ناشی از جهش های ایجاد شده در ساختار لوسیفراز و یا چینش تک واحدهای کریستال کنار یک دیدگر باشد. آنالیز اطلاعات هم چنین نشان می دهد که این لوپ به وسیله ی شبکه ای از باندهای هیدروژنی به طور غیر مستقیم با جایگاه فعال در ارتباط است. آنالیز ریزتر ساختار نشان داد که انرژی الکتروستاتیک بعضی از اسیدآمینه های جایگاه فعال در این لوسیفراز نسبت به لوسیفراز p. pyralis تفاوت بارزی را نشان می دهد. مطالعات نهایی ما نشان داد که جهش های ایجاد شده در ساختار لوسیفراز گونه ی جهش یافته ی (e354r/356r) l. turkesranicusممکن است بر انرژی الکتروستاتیک موضعی ساختار لوسیفراز تاثیر گذاشته باشد-که به علت نبود ساختار لوسیفراز طبیعی نمی توان نتیجه گیری قطعی نمود-. حرکات برد-کوتاه و برد-بلند پروتئین تحت تاثیر این تغییر موضعی انرژی الکتروستاتیک قرار می گیرند و در نهایت نفوذپذیری آب به درون پروتئین افزایش می یابد. این افزایش نفوذپذیری آب به درون ساختار موجب تغییر رنگ نور انتشار یافته از لوسیفراز جهش یافته می گردد.

آنتی بادی های منوکلونال توسط سلولهای هیبریدوما که نامیرا هستند ترشح شده و به صورت اختصاصی یک اپی توپ خاص را شناسایی می کنند. هیبریدوما از ادغام سلولهای لنفوسیت میرای تولید کننده آنتی بادی با سلولهای نامیرای میلوما بوجود می آید. آنتی بادی های منوکلونال در مطالعات دارویی، تشخیص بیماریها ودرمان برخی بیماریها مانند عفونتها و سرطانها استفاده می شوند. آنتی بادی ها ابزار مفیدی در دست محققان بوده و منجر به پیشرفتهای قابل توجهی در زمینه دارویی می شوند. لوسیفراز حشره شب تاب گونه ی فوتینوس پیرالیس یک آنزیم گزارش دهنده است که واکنش بیولومینسانس را کاتالیز می کند. لوسیفراز نقش مهمی در تصویر برداری از تومورها ومتاستاز دارد. ما مونوکلونال آنتی بادیهایی علیه لوسیفراز تولید کردیم که برای سیستمهای آشکارساز آزمایشگاهی مثل وسترن بلات،الایزا،ایمونوهیستوشیمی و.... به کار میرود. برای این کار پروتئین لوسیفراز متصل به his-tag، که در e.coliبیان شده بود را با ستون نیکل سفاروز، تخلیص کردیم. پروتئین های تخلیص شده را با روش بردفورد، تعیین غلظت کردیم. چند موش balb/c با 50µgr از آنتی ژن خالص شده برای هر موش، ایمونیزاسیون کردیم. سلول های میلومای موشی(sp2) که برای رسیدن به فاز لگاریتمی رشد،کشت داده شده بودند با سلول های لنفوسیتی بدست آمده از طحال موش ادغام شدند. پس از اینکه سلول های لنفوسیت با میلوما به نسبت 5 به 1 مخلوط شدند peg1500 اضافه کردیم تا سبب ادغام غشای سلول ها در هم شود. پس از 5 بار هیبریداسیون در میان کلنی های بدست آمده، یک کلون هیبریدوما بدست آمد که آنتی بادی های منوکلونال با افینیتی بالا و ویژگی اختصاصی نسبت به لوسیفراز ترشح می کرد. اتصال اختصاصی این آنتی بادی ها به لوسیفراز با الایزا و وسترن بلات نشان داده شد.

چکیده: پدیده بیولومینسانس تبدیل انرژی شیمیایی به نور توسط موجودات زنده را گویند که واکنشی آنزیمی می باشد که به واسطه دخالت آنزیم لوسیفراز و سوبسترای لوسیفرین انجام می گیرد. لوسیفرازآنزیمی پراکسیزومی می باشد که طی دو مرحله، مرحله ی لیگازی با استفاده از atp و mg2+ و مرحله ی مونواکسیژنازی و با استفاده از o2 باعث تبدیل سوبسترای خود (لوسیفرین) به ترکیب برانگیخته ی اکسی لوسیفرین می شود که در هنگام برگشت به حالت پایه ایجاد نور با بازده کوانتومی بالا می کند. آنزیم لوسیفراز دارای کاربردهای فراوان صنعتی و تشخیصی می باشد ولی عواملی همچون پایداری پایین لوسیفراز نسبت به حرارت و km بالا برای سوبسترای atp استفاده از آن را محدود کرده است. از این روی درسالهای اخیر با توسعه فناوری و با بکارگیری جهش زایی های هدفمند سعی در تهیه نمونه جهش یافته مناسب برای بهره گیری بیشتر از این آنزیم صورت گرفته است. مطالعات مهندسی پروتئین برای این آنزیم حاکی از این است که اسید های آمینه باردار دارای فراوانی بالایی بخصوص در نواحی سطحی پروتئین های گرما دوست می باشند. همچنین مطالعات قبلی بیانگر این است که جهش زایی در جایگاه 300 آنزیم لوسیفراز برخصوصیات سیننتکی وپایداری تاثیر می گذارد . به منظور ارزیابی اثر بارهای سطحی اسیدهای آمینه باردار و نقش جایگاه 300 )که در لوپ سطحی واقع شده است ( بر پایداری آنزیم لوسیفراز، جهش زایی در لوسیفراز lampyris turkestanicus به صورت جهش های منفرد l300r,l300k,l300e انجام شد. بیان و تخلیص هر دو لوسیفراز طبیعی و جهش یافته جهت مطالعه ویژگیهای سنتتیکی و ساختاری صورت گرفت. طیف سنجی نشری بیانگر این است که جایگزینی این اسید آمینه با اسیدهای آمینه باردار در 7.8=ph بر روی ماکزیمم طول نشری فاقد اثر است. افزایش فعالیت ویژه لوسیفراز برایe l300k,l300 نیز مشهود است. جهش زایی l300r با افزایش دمای بهینه همراه بود. بررسی فعالیت باقی مانده نسبی درشرایط 35 درجه بمدت 60 دقیقه بیانگر افزایش فعالیت باقی مانده در جهش یافته l300r,l300k نسبت به نمونه طبیعی بوده است.

تکنیک های کشت آزمایشگاهی فولیکول ها نه تنها مدلی را برای بررسی فرایند فولیکولوژنز فراهم می کند بلکه همراه با انجماد بافت تخمدان در موارد بالینی برای حفظ باروری ممکن است کاربرد داشته باشد. هدف از این مطالعه، ارزیابی تاثیر کیت لیگاند (kl) و فاکتور مهار کننده لوسمی (lif) بر بلوغ و مرگ سلولی برنامه ریزی شده فولیکول های تخمدان موش پس از انجماد شیشه ای و کشت سه بعدی بود. مطالعه به روش تجربی بر روی موش های نابالغ 7 روزه نژاد nmri انجام شد. در مرحله اول تخمدان ها به روش انجماد شیشه ای با استفاده از محلول انجمادی حاوی اتیلن گلیکول منجمد شدند و از لحاظ مورفولوژیکی، فراساختار وآپوپتوز با تخمدان های غیرانجمادی مقایسه گردید. در مرحله دوم بافت تخمدان انجمادی و غیر انجمادی در محیط کشت پایه ?-mem غنی شده با kl و lif در مقایسه با گروه شاهد به مدت 7 روز کشت داده شد. میزان رشد فولیکول ها، مساحت تخمدان، تولید هورمون، آپوپتوز در تمام گروههای مورد مطالعه بررسی شد. در مرحله سوم فولیکول های پره آنترال جدا شده از بافت تخمدان کشت داده شده در محیط کشت ?-mem تکمیل شده با 5% fbs، 1% its ، miu/ml 100 rfsh ، ng/ml 10 regf و نیز kl به مدت 12 روز در سیستم کشت دوبعدی و سه بعدی کشت داده شد و پس از پایان دوره کشت تخمک گذاری القا شد. در پایان دوره کشت میانگین قطر، میزان رشد و بلوغ فولیکولها، تولید هورمون و آپوپتوز بررسی شد. در مرحله آخر میزانreactive oxygen species (ros) ، atp، پراکندگی میتوکندری وتکوین جنین در تخمک های بالغ به دست آمده از مراحل قبل مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج مرحله اول نشان داد که تخمدان انجمادی از نظر مورفولوژی، فراساختاری و آپوپتوزی مشابه تخمدان غیرانجمادی بود. در مرحله دوم درصد فولیکول های پره آنترال، مساحت تخمدان ، تولید هورمون در تخمدان های غیر انجمادی کشت شده در محیط پایه غنی شده با kl به طور معنادار بالاتر و میزان فعالیت کسپاز 3/7 نیز کمتر از سایر گروه ها بود (001/0p<). نتایج مرحله سوم نشان داد که بالاترین میزان بقا، درصد تخمک های متافاز دوم و تولید هورمون فولیکول ها کشت شده در محیط غنی شده با klدر سیستم کشت سه بعدی بود. میزان فعالیت کسپاز 3/7 در فولیکول های کشت شده در سیستم کشت سه بعدی کم تر ازکشت دو بعدی بود (05/0p<). نتایج مرحله آخر نشان داد که میزانros، atp و پراکندگی میتوکندری در تخمک های بالغ حاصل از فولیکول های کشت شده تفاوتی با یکدیگر نداشتند، اما اختلاف معنادار با تخمک های بالغ in vivo داشتند و میزان تکوین جنین ها در گروه کشت سه بعدی بالاتر بود. به طور کلی نتایج نشان داد که کشت کامل تخمدان و کشت سه بعدی فولیکول ها همراه با فاکتورkl باعث بهبود رشد و تکوین فولیکول های بدوی در تخمدان می شود.

سلول های بنیادی جنینی موشی ابزاری ارزشمند برای انجام مطالعات تمایز سلولی در شرایط in vitro هستند. تمایز سلولی فرایندی جدایی ناپذیر از رشد و نمو موجودات پرسلولی است. در این مطالعه نقش مسیر آپوپتوتیک میتوکندریایی و تغییرات سطح انرژی سلول در فرایند تمایز سلول های بنیادی موشی به کاردیومایوسیت و آپوپتوز بررسی شده است.

با کمک باکتریe.coli sm10 توانستیم سویه ای لومینسانس با وارد کردن ژن لاکس به کروموزوم باکتری تهیه کنیم که در حضور آلاینده های مختلف میزان نور تولیدی لومینسانس کاهش می یابد که همین نشانگری برای حضور آلاینده در محیطمی باشد.بارسم نمودار اثر غلظت های مختلف بر روی این سویه سنجیده شد ودر مورد آلاینده های آلی حساست بیشتری از خود نشان داد.البته ما حضور آلاینده را در محیط آبی در آزمایشگاه ودر محیط طبیعی (آب چاه شرب) انجام گرفت.پلاسمید حامل ژن لاکسدارای ترانسپوزون بود که با روش ترانسفورماسیون با کمک بافر پایپس بطور پایدار وارد کروموزوم باکتری گردید.