نام پژوهشگر: نعمت سخندان

بررسی فعالیت acc دآمیناز در ازتوباکترهای بومی و انتقال ژن acds از سودوموناس فلورسنس به ازتوباکتر منتخب
پایان نامه وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - دانشگاه تبریز - دانشکده کشاورزی 1388
  داود فرج زاده   ناصر علی اصغرزاد

یکی از مکانیسم های باکتری های ریزوسفری محرک رشد گیاه (pgprs) برای تحریک رشد گیاهان از طریق فعالیت آنزیم 1-آمینو سیکلوپروپان-1-کربوکسیلیک اسید (acc) دآمیناز می باشد. باکتری های حاوی این آنزیم، با تجزیه پیش ماده اتیلن گیاهی (acc)، غلظت آن را در گیاه در حال رشد و یا تحت تنش کاهش داده و در نتیجه گیاه را در مقابل اثرات مضر ناشی از سطوح بالای اتیلن (اتیلن تنشی) حفظ می کنند. اگر چه بسیاری از گونه های ازتوباکتر رشد گیاهان را تحریک می کنند، اما با وجود این، تاکنون گزارشی دال بر تولید آنزیم acc دآمیناز توسط اعضای این جنس وجود ندارد. بنابراین، برای اثبات این موضوع در وهله اول، تعدادی از ایزوله های ازتوباکتر بومی از خاک های تحت کشت گندم و جو مناطق مختلف (محیط های تحت تنش خشکی و شوری) اطراف تبریز، جداسازی، خالص سازی و شناسایی شدند و از نظر acc دآمیناز بطریق بیوشیمیایی و مولکولی مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج حاصله حاکی از عدم وجود و فعالیت آنزیم acc دآمیناز در سویه های مورد مطالعه بود. بنابراین در وهله بعدی، به منظور ارتقا خصوصیات pgprی ازتوباکتر، اقدام به انتقال ژن کد کننده acc دآمیناز (acds) به سویه بومی منتخب ازتوباکتر گردید. برای انجام اینکار، ابتدا چندین سویه باکتری سودوموناس بومی با فعالیت acc دآمینازی جداسازی و خالص سازی گردید. سپس با استفاده از تکنیک pcr، ژن acds از یک سویه سودوموناس بومی با فعالیت acc دآمینازی بالا (pseudomonas fluorescens strain fy32) تکثیر گردید. بررسی های بیشتر نشان داد که این ژن جایگاه پلاسمیدی داشته و در یک پلاسمید حدود kbp50(pfy32) قرار دارد. یکسانی در الگوی برش آنزیمی ژن acds حاصل از pcrی dnaکل و پلاسمیدی این باکتری و نیز با انتقال pfy32 به سویه dh5? باکتری escherichia coli این موضوع اثبات گردید. سپس ژن acds تکثیر شده در یک وکتور مناسب (pbluescript ii ks-) کلون (pbkacc1) و توالی یابی گردید. آنالیز ژنی به ترتیب 94 و 98 درصد شباهت در سطح اسید نوکلئیک و پروتئین با توالی acds باکتری pseudomonas sp. 6g5 نشان داد. همچنین، رسم درخت فیلوژنی توالی های acds موجود و مقایسه آن با درخت فیلوژنی توالی های 16s rrna متناظر، حاکی از انتقال افقی ژن در داخل اعضای یک رده بود. سپس با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی biac f, azbacr و نیز biac f, r و pbkacc1 بعنوان الگو، دو واکنش pcr دیگر انجام، و محصولات آن بترتیب در وکتورهای pbluescript ii ks- و pbr322 کلون شده (بترتیب pbkacc2 و pbracc) و سپس در پلاسمیدهای(+)pet28a و pbi121 بترتیب تحت کنترل پروموترهای t7 و camv 35s ساب کلون گردیدند و نهایتاً پلاسمیدهای نوترکیب pet28acc و pbiacc که قابلیت بیان ژن acds را دارا بودند، ساخته شدند. به منظور بیان سیتوپلاسمی ژن acds، انتقال پلاسمید pbiacc به باکتری azotobacter vinelandii fy10 بومی منتخب از طریق الکتروپوریشن انجام شد. در ترانسفورمانت حاصله، بیان و فعالیت آنزیم acc دآمیناز با روش اندازه گیری کمی تائید شد. همچنین پایداری پلاسمید انتقالی در باکتری نوترکیب حاصله طی 10 کشت متوالی با کشت های مکرر در محیط کشت های بدون آنتی بیوتیک حاکی از پایداری بسیار بالای این پلاسمید بود. ارزیابی تاثیر تلقیح سویه باکتری تراریخت روی گیاه گندم حاکی از اثر مثبت و معنی دار آن بر وزن تر ریشه و بخش هوایی بترتیب در مقایسه با سویه وحشی و شاهد بدون تلقیح بود. این اولین گزارش در مورد انتقال و بیان آنزیم acc دآمیناز بعنوان یک خصوصیت pgprای دیگر ازتوباکتر می باشد.

شناسایی و بررسی تنوع ژنتیکی جدایه های باکتری scabies streptomyces عامل اسکب معمولی سیب زمینی در آذربایجان شرقی و کردستان
پایان نامه وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - دانشگاه تبریز - دانشکده کشاورزی 1390
  علی احمدی   نعمت سخندان

بیماری اسکب معمولی سیب زمینی (common scab ( یکی از بیماریهای مهم است که به وسیله ی باکتری streptomyces scabies و سایرگونه های مشابه دیگر بر روی سیب زمینی و سایر سبزیجات غده ای(تربچه ، شلغم وغیره) ایجاد میشود. این بیماری به وسیله ی باکتری خاکزی گرم مثبت streptomyces ایجاد میشود. ایجاد علایم زخم های نکروتیک برجسته ، سطحی یا فرورفته از علایم مشخص اسکب معمولی بر روی غده های سیب زمینی است که ارزش بازارپسندی و کیفیت غده های سیب زمینی را کاهش داده و باعث خسارت اقتصادی به محصول میشود. طی سال 1389 از مناطق مختلف استانهای آذربایجان شرقی و کردستان غده های دارای علایم اسکب جمع آوری و به آزمایشگاه منتقل گردید. و براساس ویژگیهای مورفولوژیکی ، فیزیولوژیکی و تستهای بیوشیمیایی 30 جدایه استرپتومایسس جداسازی شد. همچنین واکنش زنجیره ای پلی مراز برای شناسایی ژن txta که در بیماریزایی بیشتر استرینهای گونه های s.scabies ، s.acidiscabies و s.turgidiscabies نقش اساسی ایفا میکند انجام شد. واکنش زنجیره ای پلی مرازکه برای شناسایی جنس streptomyces و گونه ی scabies انجام شد منجر به شناسایی 30 جدایه به عنوان استرپتومایسس گردید(اندازه باندbp 1027 ) و 26 جدایه نیز به عنوان گونه ی s. scabies تعیین شد. (اندازه باندbp 475) . به منظور ارزیابی دامنه تنوع ژنتیکی جدایه های s. scabies ، dna ژنومی جدایه ها استخراج ودر واکنش زنجیره ای پلی مراز با روشهای eric ، rep و box-pcr و با آغازگرهای eric 2f، eric 1r ،rep2f، rep1r و box-air به کار برده شدند. محصولهای تکثیر شده در ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز و با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی شدند. از ضریب تشابه جاکارد (jaccard) برای تعیین تشابه جدایه ها واز روش upgma و نرم افزار ntsys نسخه 2.02 برای آنالیز خوشه ای استفاده شد. آنالیز خوشه ای نتایج بدست آمده با آغازگرهای eric 2f، eric 1r نشان داد که در سطح تشابه 75درصد،بر اساس آغازگرهای eric 2f ، eric 1r جدایه ها به 8 گروه ، با آغازگرهای ،rep2f، rep1r به 5 گروه ، و با آغازگرbox-air به 7 گروه تقسیم شدند. بدین ترتیب نتایج نشانگر وجود تنوع ژنتیکی درون جدایه های s.scabies عامل بیماری جرب معمولی سیب زمینی بود.

بررسی تشکیل کپسید های ویروس موزاییک خیار پس از بیان کپسید پروتئینی ویروس در escherichia coli
پایان نامه وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - دانشگاه تبریز - دانشکده کشاورزی 1390
  افشین رستمی   نعمت سخندان

cucumber mosaic virus (cmv) یکی از مهم ترین ویروس های آلوده کننده اعضای خانواده کدوئیان و متعلق به جنس cucumovirus و خانواده bromoviridae می باشد. این ویروس دارای دامنه میزبانی بسیار وسیعی است و گونه های گیاهی زیادی از خانواده های مختلف را آلوده می کند. آن دارای ژنوم چند بخشی شامل سه قطعه آران ای تک رشته ای، دو آران ای زیرژنومی و در برخی از جدایه ها دارای آران آی ماهواره ای است.rna1 به عنوان بزرگترین قطعه ژنوم ویروس بوده و دارای 3357 نوکلئوتید است و پروتئین 1a را کد می کند. rna2 حاوی 3050 نوکلئوتید و پروتئین 2a را رمز می کند. rna3 حاوی حدود 2200 نوکلئوتید و دارای دو سیسترون 3a و cp می باشد. پروتئین 3a توسط orf قرار گرفته در مجاورت ´5 رمز می شود. دومین orf موجود در orf3، پروتئین پوششی (26 کیلو دالتون)را کد می کند که در طرف ´3 مولکول rna3 قرار گرفته و از طریق rna4 زیر ژنومی کد می شود. این پروتئین به همراه پروتئین 3a (پروتئین حرکتی) برای حرکت سلول به سلول در میزبان مورد نیاز هستند. پروتئین های 1a و 2a نیز در همانندسازی ویروس ضروری هستند. ذرات ویروسی چند وجهی به قطر 29 نانومتر و بدون غلاف هستند و در طبیعت توسط شته ها به روش ناپایا منتقل می شوند. این ویروس بر طبق خصوصیات سرولوژیک و ترادف نوکلئوتیدی در دو زیرگروه طبقه بندی می شوند. هدف این پژوهش، بیان ژن پروتئین پوششی ویروس موزاییک خیار در سیستم پروکاریوتی باکتریrosetta escherichia coli بود. بخشی از آر ان ای سوم ویروس cmv ( استرین b13) که پروتئین پوششی را رمز می کند، قبلا با استفاده از آغازگرهای اختصاصی از روی cdna تکثیر و همسانه سازی شده بود. در این تحقیق از کلونی باکتریایی همسانه شده ی واجد ptz57cmvcp پلاسمید رشد داده شد و به روش لیز آلکالینی استخراج شد. سپس برش آنزیمی با آنزیم های bamhi و saci برروی این پلاسمید انجام شد. قطعه مورد نظر، به حامل بیان pet21a(+) برش داده شده توسط آنزیم های bamhi و saci اتصال داده شد و این فراورده به درون باکتری e.coli انتقال داده شد. پس از بیان پروتئین پوششی cmv در e.coli strain rosseta gami، اندازه ی آن در sds-page بررسی شد. وزن مولکولی این پروتئین در حدود 30 کیلو دالتون بود که بدون احتساب چند اسیدآمینه افزوده شده توسط انتهاهای n و cحامل، با اندازه ی پروتئین پوششی cmv که kda 26 است، مطابقت داشت. پروتئین پوششی cmv نوترکیب بیان شده در باکتری، با استفاده از آزمون های das-elisa، diba و وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت. در همه این موارد نتایج به دست آمده تایید کننده بیان ژن مورد نظر بودند. در نهایت تشکیل پروتئین پوششی ویروس cmv با استفاده از میکروسکوپ الکترونی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این مطالعه نشان داد علاوه بر تایید بیان این پروتئین و تشکیل ذرات شبه ویروسی را نیز اثبات کرد.