نام پژوهشگر: محسن گرگانی

ساختار و عمل در دو آنزیم آلفا آمیلاز از‏‎b.licheniformis‎‏ و ‏‎b.amyloiquefaciens‎‏
پایان نامه وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - دانشگاه تهران 1379
  خسرو خواجه   محسن گرگانی

در این مطالعه ابتدا پایداری حرارتی آلفا آمیلازهای مزوفیل (حاصل از ‏‎baa, bacillus amyloliquefaciens‎‏) و ترموفیل (حاصل از ‏‎bla, bacillas licheniformis‎‏) و اثرات عوامل دناتوره کننده، حلال های آلی و پایدارکننده ها بررسی شد. آنزیم ترموفیل در حلال آبی مقاومت بیشتری در مقابل عوامل دناتوره کننده داشت ولی چنین تفاوتی در شرایط غیرآبی مشاهده نشد. به علاوه پایداری این دو آنزیم در حضور یکسری از پایدارکننده ها افزایش یافت. از میان پایدارکننده های مختلف سوربیتول بیشترین مقاومت ساختاری در این دو آنزیم ایجاد نمود، به طوری که همزمان افزایش ‏‎tm‎‏ و کاهش دآمینه شدن این پروتئین ها در اثر حرارت مشاهده شد. مطالعه مقایسه ای پروتئولیز محدود و وسیع ‏‎bla, baa‎‏ با استفاده از تریپسین انجام گرفت. طبق انتظار، آنزیم مزوفیل مقاومت بیشتری در مقابل هضم توسط تریپسین از خود نشان داد. در طی فرآیند پروتئولیز فعالیت ‏‎baa‎‏ کاهش یافت ولی بالعکس فعالیت ‏‎bla‎‏ افزایش پیدا کرده و به طور همزمان کاهش در پایداری حارتی آن مشاهده شد. با اندازه گیری های ‏‎cd‎‏، مشخص شد که ‏‎tm‎‏ آنزیم در اثر تیمار با تریپسین از 89 درجه سانتیگراد به 86 درجه سانتیگراد می رسد که نشاندهنده افزایش انعطاف پذیری در طی این فرآیند است. در حضور پایدارکننده ها هضم پروتئولیتیکی هر دو آنزیم کاهش یافت. این پدیده احتمالا ناشی از پایدارشدن (سخت تر شدن) این آنزیم ها در حضور پایدارکننده ها است. افزایش پایداری می تواند ناشی از هیدراسیون ترجیحی پروتئین ها در حضور این افزودنی ها باشد. الگوی هضم با توجه به اطلاعات بیوشیمایی در رابطه با ساختار این پروتئین ها و حرکات موضعی در نواحی لوپ مورد بحث قرار گرفت. دستکاری شیمیایی رزیدوی لیزین در دو آلفا آمیلاز باکتریائی، ‏‎bla, baa‎‏ ، با استفاده از سیتراکونیک انیدرید مورد بررسی قرار گرفت. این تغییر باعث افزایش فعالیت و پایداری در این دو آنزیم گردید به طوری که پایداری ‏‎baa‎‏ در 80 درجه سانتیگراد افزایش یافت و فعالیت ‏‎bla‎‏ در 15 درجه سانتیگراد، پانزده برابر شد و ‏‎kcat/ km‎‏ آن سه برابر گردید. غیرفعال شدن برگشت ناپذیر و اندازه گیری های ‏‎cd‎‏ این متالوآنزیم ها در حالات طبیعی و دستکاری شده در حضور و عدم حضور کلسیم ‏‎(10mm)‎‏ مورد بررسی قرار گرفت. مطالعات ‏‎cd‎‏ نشان داد که با دستکاری شیمیایی ساختار سوم این پروتئین ها تغیر یافته که در حضور کلسیم تعدیل می شود. سوربیتول در حضور و عدم حضور کلسیم، پایداری فرم های مختلف این دو آنزیم را به طور موثری افزایش داد. نتایج از لحاظ اهمیت کاربردی این دیدگاه در جهت افزایش همزمان پایداری و فعالیت آنزیمی مورد بحث قرار گرفت.