سوربیتول دهیدروژناز (sdh, ec 1.1.1.14) دومین آنزیم مسیر پلی اُل می باشد. sdh، واکنش برگشت پذیر تبدیل سوربیتول به فروکتوز، با مصرف nad+ را کاتالیز می کند. مسیر پلی اُل در وضعیت طبیعی بدن فعالیت کمی دارد، اما هایپرگلایسمی مزمن ناشی از بیماری دیابت سبب افزایش فعالیت مسیر پلی اُل و کاهش فعالیت آنزیم sdh می شود. نتیجه این تغییرات افزایش فشار اسمزی درون سلول به دلیل تجمع سوربیتول می باشد که عوارضی از قبیل کاتاراکت دیابتی را سبب می شود. در مطالعه حاضر اثر فرآیند گلایکیشن بر ساختار و سینتیک آنزیم sdh مورد بررسی قرار گرفته است. به این منظور آنزیم sdh از کبد گوسفند استخراج و با روش هایی چون جزء جزء سازی با آمونیوم سولفات، کروماتوگرافی تعویض یونی و کروماتوگرافی تمایلی تا حد زیادی(70 برابر) خالص شده است. سپس با محاسبه پارامترهای سینتیکی آنزیم و همچنین ثابت تعادل آنزیم مشخص شد که در حالت طبیعی، تمایل آنزیم به کاتالیز مسیر رفت واکنش (تبدیل سوربیتول به فروکتوز) بیشتر است. در ادامه برای القای گلایکیشن، آنزیم در حضور قندهای فروکتوز و ریبوز انکوبه شده و تاثیر این شرایط روی ساختار آنزیم sdh با انجام فلورسانس مورد بررسی قرار گرفت. نتایج مربوط به فلورسانس ذاتی و فلورسانس وابسته به age با آشکار سازی افزایش نشر فلورسنس در پروتئین مورد آزمایش، گلایکه شدن آنزیم sdh در شرایط فوق را تایید می کنند. در بررسی اثر شرایط هایپرگلایسمی روی سینتیک آنزیم با محوریت تغییر ثابت تعادل (محاسبه به روش هالدن) مشخص شد که در اثر گلایکیشن ثابت تعادل آنزیم (در مسیر اکسیداسیون سوربیتول) کاهش یافته و تمایل آنزیم به کاتالیز مسیر رفت واکنش کمتر می شود. در نتیجه سوربیتول در درون سلول تجمع یافته و با بالا بردن فشار اسمزی، منجر به بروز تورم و ایجاد عارضه می گردد. با توجه به پیچیدگی فرآیند های درگیر در بیماری دیابت و گستردگی عوارض ناشی از آن، تحقیقاتی ار این دست می توانند با افزایش درک و شناخت ما نسبت به مکانیسم های ایجادکننده عوارض بیماری دیابت، در انتخاب راهکار های درمانی مناسب مفید باشند.

در این تحقیق آنزیم تریپسین از ضمائم پیلوریک ماهی کیلکای معمولی دریای خزر از طریق راسب سازی با آمونیوم سولفات (60-30 درصد)، کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون (سفادکس جی 75) و تعویض یونی (دی اتیل آمینو اتیل – سلولز) تخلیص گردید. میزان تخلیص تا 3/28 برابر و میزان بازده تا 12درصد بدست آمد. وزن مولکولی تریپسین تخلیص شده بر اساس سدیم دو دسیل سولفات- پلی اکریل آمید ژل الکتروفورزیز(sds-page) 2/23 کیلودالتون بود و بر اساس native-page وsubstrate-gel الکتروفورزیز فقط دارای یک ایزوفرم بود. شناسایی ویژگی های بیوشیمیایی آنزیم تریپسین تخلیص شده از ضمائم پیلوریک ماهی کیلکای معمولی دریای خزر (ckt) و آنزیم پانکراتیک خوک (pt) نشان داد که دما و ph بهینه برای هر دو آنزیم به ترتیب c°60 و 8 بود. پایداری دمایی برای آنزیم تریپسین ckt تا c° 45 و برای pt تا c°50 بود. پایداری ph برای آنزیم تریپسین ckt در محدوده 10-7 و برای آنزیم تریپسین خوک در محدوده 11-4 قرار داشت. فعالیت آنزیم تریپسین cktو pt در برابر مهارکننده های sbti و tlck کاهش معنی داری را با نمونه شاهد که فاقد مهارکننده بود نشان دادند بطوریکه درckt این مهارکنندگی به 100 درصد رسید (05/0>p). pmsf و پاراآمینوبنزآمیدین نیز باعث مهارکنندگی معنی داری در فعالیت آنزیم تریپسین درckt و pt گردیدندکه با نمونه شاهد اختلاف معنی داری را نشان داد (05/0>p). مهارکننده های tpck و بتامرکپتواتانول هیچگونه اثر مهارکنندگی بر روی آنزیم تریپسین ckt نداشتند (05/0> p) ولی درpt کاهش معنی داری را در فعالیت آنزیم تریپسین ایجاد نمودند (05/0> p). پپاستاتین a، یدواستیک اسید و edta اثر مهارکنندگی معنی داری در فعالیت آنزیم تریپسین در ckt و pt نشان ندادند (05/0<p). یون های فلزی کلسیم، منیزیم و منگنز باعث افزایش معنی دار فعالیت آنزیم تریپسین ckt و pt و یون های مس، روی، باریم، کبالت، آهن و آلومینیوم باعث کاهش معنی دار فعالیت آنزیم تریپسین در ckt و pt گردیدند (05/0>p). یون های سدیم و پتاسیم تاثیری در فعالیت آنزیم تریسینckt نداشتند (05/0<p) ولی در pt باعث کاهش معنی داری در فعالیت گردیدند(05/0>p). سورفاکتانت ها به استثنای سدیم دو دسیل سولفات (sds) اثر افزایشی معنی داری بر فعالیت آنزیم تریپسین ckt و pt نسبت به نمونه شاهد داشتند (05/0>p) در حالیکه sds باعث کاهش معنی داری در فعالیت آنزیم تریپسین ckt و pt نسبت به نمونه شاهد گردید (05/0>p). عوامل اکسیدکننده پراکسید هیدروژن و سدیم پربورات باعث کاهش معنی داری در فعالیت آنزیم تریپسین ckt و pt نسبت به نمونه شاهد گردیدند (05/0>p). مطالعه کینتیک آنزیم تریپسین cktو pt نیز نشان داد که مقدار ثابت میکائیلیس-منتن (km) برای آنزیم تریپسین ckt بطور معنی داری کمتر از pt بود (05/0>p). ثابت کاتالیزوری (kcat) و کارایی کاتالیزوری(kcat/km) ckt بطور معنی داری بیشتر از pt بود (05/0>p). نتایج این تحقیق نشان داد که پروتئاز تخلیص شده از ضمائم پیلوریک ماهی کیلکای معمولی با توجه به اثر مهارکنندگی کامل مهارکننده های اختصاصی sbti و tlck، آنزیم تریپسین بوده و از آنجائیکه این آنزیم در برابر pmsf که یک مهارکننده پروتئازهای سرین می باشد، دچار افت فعالیت گردید، بنابراین پروتئاز تخلیص شده یک پروتئاز سرین است.