کلزا به عنوان گیاه روغنی در مناطق خشک و نیمه خشک کشورمان کشت می گردد. بنابراین این گیاه در معرض شوری قرار دارد. لذا افزایش تحمل آن به شوری ضروری به نظر می رسد. لذا هدف از این تحقیق انتقال ژن پیروفسفاتاز واکوئلی آرابیدوپسیس به کلزای پاییزه رقم slm046 با استفاده از حامل pbi121 و از طریق اگروباکتریوم نژاد gv3101 و lba4404 در جهت افزایش تحمل آن به شوری است. برای انتقال ژن به این رقم از دو نوع ریزنمونه کوتیلدون و هیپوکوتیل، od600 یک و چهار دهم و نیترات نقره صفر و پنج میلی گرم استفاده گردید. گزینش ریزنمونه ها در حضور 25 میلی گرم برلیتر کانامایسین و 400 میلی گرم بر لیتر سفوتاکسیم صورت گرفت. برای شاخه زایی از 2/0 میلی گرم بر لیتر bap و برای ریشه زایی از 2 میلی گرم بر لیتر iba استفاده گردید. بهترین باززایی با استفاده از ریزنمونه کوتیلدون، od600 چهار دهم و در حضور پنج میلی گرم برلیتر نیترات نقره صورت گرفت. گیاهان تراریخته احتمالی بعد از ساقه دهی و ریشه دهی و سازگار شدن به شرایط خارج شیشه به سردخانه جهت القای گلدهی و به گلخانه جهت بذر گیری منتقل شدند. در مجموع 8 لاین در این آزمایش تولید گردید که 6 لاین در مرحله سازگاری بوده و 2 لاین در گلخانه در مرحله جوانه گل به سر می برند. واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از پرایمر اختصاصی ژن avp1، تراریخته بودن همه لاین های حاصله را تایید کرد.

گوجه فرنگی، گیاهی است که از جنبه های غذایی، اقتصادی و علمی از اهمیت بالایی برخوردار است. با توجه به حساسیت این گیاه زراعی نسبت به تنش های زیستی و غیر زیستی، بهینه سازی روش های کشت بافت و اصلاح ژنتیکی این گیاه در جهت بهبود شرایط کمی و کیفی آن، مفید به نظر می رسد. برای این آزمایش سه رقم زراعی گوجه فرنگی تحت کشت در آذربایجان شرقی شامل ارقام، چیف، اوربانا و ارومیه کم رنگ، انتخاب شدند. در این تحقیق برخی از عوامل موثر در باززایی و تراریختی گوجه فرنگی از جمله ترکیب محیط کشت پایه و هورمون ها (bap، iaa، naa و kin)، نوع ریزنمونه (برگ لپه ای و هیپوکوتیل)، نژاد آگروباکتریوم (gv3101، lba4404 و agl1)، غلظت های مختلف آگروباکتریوم، مدت زمان پیش کشت و میزان استوسرینگون، مورد مطالعه قرار گرفتند. بر خلاف ریزنمونه های برگ لپه ای، ریزنمونه های هیپوکوتیل بازدهی پایینی را در باززایی نشان داد و گیاه تراریخته ای با استفاده از این ریزنمونه بدست نیامد. از بین تیمارهای هورمونی محیط کشت پایه ms حاوی 5/1 میلی گرم در لیتر bap و 1/0 میلی گرم در لیتر iaa بهترین نتایج را برای باززایی نشان داد. از بین ارقام مورد مطالعه، رقم اوربانا بیشترین میزان باززایی را نشان داد. بیشترین میزان ساقه زایی در محیط کشت ms تکمیل شده با 1/0 میلی گرم در لیتر bap بهترین محیط ساقه زایی انتخاب شد، همچنین محیط کشت ms حاوی 2 میلی گرم در لیتر iba محیط ریشه-زایی مناسب بود. در آزمایش های تراریختی، نژاد gv3101 آگروباکتریوم تومه فسینس، بیشترین میزان گیاهان تراریخته بدست آمد، ولی با دو نژاد lba4404 و agl1، گیاه تراریخته ای بدست نیامد. بهترین غلظت (od=600)، در تراریختی با نژاد gv3101، 1 بود. پیش تیمار ریزنمونه ها به مدت دو روز، بهترین درصد تراریختی را داشتند. استفاده از استوسرینگون در مقدار 100 میکرومولار برای تراریختی مناسب بود. در طی مراحل تراریختی گیاهان تراریخته زیادی برای ژن avp1 در رقم اوربانا بدست آمد. از گیاهان منتقل شده به خاک، تعداد زیادی در جریان سازگاری به دلیل بیماری بوته میری از بین رفتند. چند گیاه در نهایت به گلخانه منتقل شده و حضور ژن avp1 در آن ها با استفاده از پرایمر آن در مرحله این ویترو و گلخانه مورد تایید قرار گرفت.

راه اندازهای ژنی از عوامل ضروری و اصلی در بیان عمومی و اختصاصی ژن ها محسوب می شوند. یکی از مسائل مرتبط با تراریخته سازی غلات جهت تغییر ترکیب پروتئین آندوسپرم و بیان ژن های هترولوگ در آن، دسترسی به راه انداز های قوی و اختصاصی آندوسپرم است. راه انداز زیر واحد با وزن مولکولی پائین گلوتنین گندم به دلیل بیان اختصاصی در آندوسپرم و غنی بودن ذخیره محصول آن در بذر گندم (70 -60 درصد از گلوتنین) که نمایانگر قدرت بالای آن می باشد، انتخاب گردید. در راستای این هدف، dna کل گندم در مرحله دو برگچه ای با استفاده از روش ctab استخراج شد. ناحیه راه انداز توسط pcr و با استفاده از آغازگر های اختصاصی طراحی شده بر اساس بانک اطلاعات نوکلئوتیدی ncbi تکثیر شد. قطعه هدف پس از اتصال به حامل همسانه سازی pgem-t جهت تراریخته سازی سلول های مستعد باکتریایی به کار گرفته شد. کلنی های سفید که حضور قطعه درجی در آن ها با کلنی pcr تائید شده بود برای کشت مایع و استخراج پلاسمید انتخاب شدند. حضور قطعه درجی از طریق برش آنزیمی با اطمینان بیشتری مورد تائید قرار گرفت و پلاسمید ها به منظور توالی-یابی به شرکت bioneer کره جنوبی ارسال شدند. بررسی بیوانفورماتیکی نتایج توالی یابی حاکی از جداسازی موفق راه انداز lmw-gs بود. راه انداز مذکور جهت بررسی فعالیت کارکردی آن در آندوسپرم، در حامل بیانی pcambia3301 درج شد. این حامل با استفاده از تفنگ ژنی به آندوسپرم بذور نارس گندم شلیک گشت. بیان موفق ژن تحت کنترل راه انداز جداسازی شده، در سلول های دریافت کننده سازه ژنی به صورت لکه های آبی رنگ نمودار گردید. این راه انداز می تواند به عنوان ابزار بیان اختصاصی در فرآیند تراریخته سازی گندم و احتمالا دیگر غلات مورد استفاده قرار گیرد

کلزا به خاطر داشتن سطوح پایین اسید چرب های اشباع از گیاهان روغنی مهم محسوب می شود. تنش شوری یکی از عوامل محدود کننده در رسیدن گیاهان به حداکثر پتانسیل ژنتیکی خود می باشد. با توجه به افزایش جمعیت جهان و نیاز روز افزون به غذا، استفاده از گیاهان تراریخته متحمل به تنش ها یکی از راهبردهای موثر در این زمینه می باشد. افزایش محتوی سلولی برخی از ترکیبات اسمز نگهدار از طریق مهندسی ژنتیک موجب بهبود تحمل گیاهان به تنش های غیرزیستی از جمله شوری شده است. از مهمترین این ترکیبات اسمزنگهدار گلایسین بتائین می باشد که آنزیم کولین اکسیداز (coda) با تبدیل کولین به گلایسین بتائین از آنزیم های مهم در این مسیر می باشد. هدف از این طرح انتقال ژن کولین اکسیداز به گیاه کلزا رقم orient برای افزایش تحمل آن به شوری می باشد. از ژن coda تحت کنترل پیشبر 35s همسانه سازی گردیده بود استفاده گردید. پلاسمید دوگانه حاوی ژن پس از تکثیر و تایید نهایی در باکتری e.coli به آگروباکتریوم نژاد gv3101 منتقل گردید. پس از آنالیز مولکولی باکتری های تراریخته برای حضور پلاسمید در آن از طریق pcr، از آن ها برای تراریخته کردن کلزا استفاده شد. در این طرح برای انتقال ژن، دو ریزنمونه کوتیلدون و هیپوکوتیل گیاه به همراه غلظت های 4/0 و 6/0 آگروباکتریوم در حضور نیترات نقره به میزان 5 میلی گرم در لیتر در مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج حاصل، نشان داد که استفاده از ریزنمونه هیپوکوتیل برای تراریختی کلزا در این آزمایش بهتر از کوتیلدون بود. بیشترین میزان تراریختی با استفاده از ریزنمونه هیپوکوتیل 20 درصد بدست آمد. شاخساره های تراریخته برای ریشه زایی به محیط ریشه زایی منتقل شدند. گیاهان تراریخته احتمالی شده در حضور ماده گزینشگر موفق به القا و گسترش ریشه شدند در حالی که گیاهان غیرتراریخته نکروزه شده و از بین رفتند. از کل گیاهان باززا شده تعداد 40 گیاه تولید ساقه و در نهایت تعداد 34 گیاه تولید ریشه کردند. گیاهان ریشه دار شده پس از استقرار در گلخانه با استفاده از آغازگرهای اختصاصی برای ژن nptii مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج حاصل نشان داد که تعداد 21 گیاه سازواره ژنی را دریافت کرده اند. گیاهان برای گلدهی تحت مراقبت های ویژه قرار گرفتند و پس از بذردهی، بذور نسل اول آنها جمع آوری گردید.

تلقیح بذر گیاهان زراعی با انواع مختلفی از باکتری های محرک رشد مانند باکتری سودوموناس فلورسنس از استراتژی های جدید مقابله با شوری است. شوری از محدودیت های اصلی کشت در اراضی کشاورزی بسیاری از مناطق دنیا خصوصأ مناطق گرم و خشکی همچون ایران محسوب می شود. این تنش غیر زیستی اثرات زیانباری بر عملکرد گیاه و کیفیت محصول دارد. کلزا از مهمترین گیاهان زراعی جهت استخراج روغن خوراکی و جزء گیاهان نیمه متحمل به شوری است. به منظور بررسی پاسخ گیاه کلزا به تنش شوری در سطح پروتئین ها، بوته های رقم حساس sarigol در دو وضعیت تلقیح شده و تلقیح نشده با باکتری p.fluorescens fy32 و در دو سطح شوری 150 و 300 میلی مولار نمک کلریدسدیم به همراه شاهد مورد بررسی قرار گرفت. آزمایش در قالب طرح کرت های خرد شده (تنش شوری بعنوان فاکتور اصلی در سه سطح و باکتری بعنوان فاکتور فرعی در دو سطح) با طرح پایه کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. پس از ظهور علائم تنش اقدام به نمونه برداری و بررسی صفات مورفولوژیک شامل وزن تر و خشک بوته، وزن تر و خشک ریشه، ارتفاع بخش هوایی و طول ریشه شد. بیشترین مقدار صفات یاد شده مربوط به سطح بدون تنش (شاهد) و کمترین آن مربوط به تنش شدید بود. همچنین گیاهان تلقیح شده با باکتری بیشترین مقدار صفات مورد نظر را نشان دادند. به منظور بررسی تغییرات بیان پروتئین های برگ رقم حساس ساری گل کلزا تحت تنش شوری 300 میلی مولار نمک کلرید سدیم و تلقیح باکتری pseudomonas fluorescens fy32 با حالت شاهد، پس از استخراج پروتئین ها از بافت برگی الکتروفورز دو بعدی صورت گرفت. پروتئین ها در بعد اول به روش ief و در بعد دوم با تکنیک sds-page تفکیک شدند. پس از رنگ آمیزی ژل ها به روش آبی کوماسی و تصویر برداری از آن ها، تجزیه لکه های پروتئینی با نرم افزارpd-quest صورت گرفت. بر اساس تیمار های اعمال شده 4 گروه از ژل ها با 3 تکرار با هم مقایسه شدند . گروه اول گروه شاهد بود که بدون شوری و بدون تلقیح با باکتری بعنوان مبنا در نظر گرفته شد و گروه های دیگر شامل شوری سطح 300 میلی مولار بدون تلقیح با باکتری، بدون تنش شوری با تلقیح باکتری و تنش شوری + تلقیح باکتری با آن مورد مقایسه قرار گرفت. با مراجعه به داده های پایگاه های اطلاعاتی و بر اساس pi و وزن ملکولی لکه ها، نسبت به شناسایی پروتئین ها اقدام شد. براین اساس 96 لکه پروتئینی تکرار پذیر بدست آمد که 20 لکه در سطح احتمال 5 درصد معنی دار بودند. پروتئین های یافت شده بر اساس عملکرد بیولوژیکی در 7 گروه پروتئین های دخیل در متابولیسم انرژی (شامل:malate dehydrogenase cytosolic، growth-regulating factor 1، pyruvate dehydrogenase، atp synthase subunit b,chloroplastic وperoxiredoxin antioxidant)، فتوسنتز (شامل: photosystem ii cp47 chlorophyll apoprotein وphotosystem ii cp43 chlorophyll apoprotein و ribulose bisphosphate carboxylase large chain)، دفاع سلولی (شامل: ، glutathion peroxidase، copper zinc superoxide dismutase وcatalase 1)،غشائی (chloroplast envelope membrane protein)، تنظیم بیان ژن و رونویسی (شامل:probable rubisco transcriptional regulator، polyphenol oxidase، dna-directed rna polymerase subunit alphaوnac transcription factor nam-b2)، واکنش های اکسایش و احیا (شامل: nad(p)h-quinone oxidoreductase subunit h, chloroplastic ، nad(p)h-quinone oxidoreductase subunit k, chloroplastic و nad(p)h-quinone oxidoreductase chain 4, chloroplastic) و فتوسنتز- متابولیسم (phospholipase a1-ii) تقسیم بندی شدند. افزایش در بیان پروتئین های آنتی اکسیدانی نشان از اهمیت تنظیم سطوح این پروتئین ها تحت تنش شوری دارد. کاهش در پروتئین های مرتبط به فتوسنتز و متابولیسم می تواند از دلایل عمده کاهش رشد در پاسخ به تنش شوری باشد.

تنش شوری یکی از مهمترین تنش‎های غیر زیستی محسوب شده و از عواملی است که گیاهان را از رسیدن به حاکثر پتانسیل ژنتیکی خود باز می‎دارد. با توجه به افزایش جمعیت و اهمیت امنیت غذایی، پژوهشگران برای غلبه بر این مشکل روش‎های مختلف زراعی و ژنتیکی را به کار گرفته‎اند. یکی از روش‎های کارآمد که اخیرا نیز مورد توجه قرار گرفته است، انتقال ژن و تولید گیاهان تراریخته متحمل به شوری است. ژن avp1یکی از ژنهایی است که انتقال آن به گیاهانی نظیر توتون، یونجه، برنج و گندم باعث افزایش تحمل این گیاهان به شوری وخشکی گردیده است. گوجه فرنگی، گیاهی است که از جنبه‎های غذایی، اقتصادی و علمی از اهمیت بالایی برخوردار است. گوجه فرنگی در مناطق خشک و نیمه خشک کشورمان کشت می‎گردد. هدف از این تحقیق انتقال ژن پیروفسفاتاز واکوئلی آرابیدوپسیس به گوجه فرنگی رقم ارومیه کم رنگ با استفاده از پلاسمید دوگانه ppzp و از طریق آگروباکتریوم gv3101، در جهت افزایش تحمل آن به شوری است. برای انتقال ژن به این به این رقم از دو نوع ریزنمونه کوتیلدون و هیپوکوتیلدون، od600دو دهم، چهار دهم و یک ، استفاده گردید. بهترین باززایی با استفاده از ریزنمونه‎های کوتیلدون،od600 چهار دهم صورت گرفت. ریزنمونه‎های پیش کشت شده با باکتری تلقیح می‎شوند و در محیط باززایی حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین قرار داده می‎شوند. گزینش ریزنمونه‎ها در حضور 25 میلی گرم بر لیتر کانامایسین و 400 میلی گرم بر لیتر سفوتاکسیم صورت گرفت. نتایج حاصل نشان داد که استفاده از ریزنمونه‎های کوتیلدون برای تراریختی گوجه‎فرنگی بهتر از هیپوکوتیلدون بود. برای شاخه‎زایی از 2/0 میلی گرم بر لیتر bap و برای ریشه زایی از 2 میلی گرم بر لیتر iba استفاده گردید. در این آزمایش 25 گیاه تا مرحله ساقه‎دهی تولید شد و 12 گیاه ریشه‎دار شدند. از گیاهان تراریخته احتمالی بعد از ریشه‎زایی، dna استخراج شده با استفاده از آغازگر ژن پیروفسفاتاز واکوئلی ، تکثیر ژن انتقالی با روش pcr انجام می‎گیرد. در نتیجه pcr ثابت شد که گیاهان تراریخته هستند. گیاهان ریشه‎دار شده برای گلدهی تحت مراقبتهای ویژه در گلخانه قرار گرفتند تا بذردهی صورت گیرد.

کلزا که به منظور استحصال روغن آن تولید می¬گردد همانند سایر گیاهان زراعی متاثر از شوری می-شود. شوری خاک به عنوان یکی از مهمترین عوامل نامساعد و تنش¬زای غیر زنده اثر نامطلوب بر میزان تولید و کیفیت محصولات کشاورزی دارد. باکتری pseudomonas fluorescens جزو باکتری¬های محرک رشد گیاه می¬باشد و در همیاری با گیاهان باعث افزایش رشد آنها و افزایش مقاومت گیاه در برابر عوامل بیماری¬زا و محدود کننده محیطی می¬گردد. در این طرح شوری در دو سطح صفر و 300 میلی مولار نمک nacl اعمال شد. حضور یا عدم حضور باکتری به عنوان تیمارهای دیگر با سه تکرار اعمال گردید و برای تجزیه¬های آماری از طرح کرت¬های خرد شده با طرح پایه¬ی کاملا تصادفی استفاده شد. وزن تر و وزن خشک اندام¬های هوایی و ریشه، ارتفاع بوته و طول ریشه به عنوان داده¬های مربوط به صفات آگرو- مورفولوژیک پس از اعمال تیمارهای یاد شده به دست آمد. به منظور بررسی پروتئین¬های دخیل در بهبود مقاومت گیاه کلزا به شوری در همیاری با باکتری pseudomonas fluorescens الگوی الکتروفورز دو بعدی پروتئوم ریشه آن مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور نخست عصاره¬ی پروتئینی بافت ریشه با روش tca- استون استخراج شد. برای بعد اول از isoelectric focusing و در بعد دوم از روش sds-page جهت تفکیک پروتئین¬ها استفاده گردید. ژل¬های حاصل پس از رنگ آمیزی به روش نیترات نقره و تصویر برداری به کمک نرم¬افزار pd-quest با ژل¬های نمونه¬های شاهد مقایسه و تغییرات بیان لکه¬های پروتئینی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که از 216 لکه¬ی ظاهر شده 16 لکه¬ی پروتئینی در اثر اعمال تنش شوری، 13 لکه¬ی پروتئینی در حضور باکتری محرک رشد گیاه و 23 لکه در صورت اعمال هر دو تیمار تغییر بیان نشان می¬دهند. پس از شناسایی احتمالی پروتئین¬های مربوطه با استفاده از معیارهای وزن مولکولی و pi مشخص شد که این پروتئین¬ها با افزایش یا کاهش بیان همراه بوده¬اند جزو پروتئین¬های دخیل در مسیرهای متابولیکی/انرژی¬زایی، پیام رسانی، حفاظت و دفاع سلولی، کانالی، پروتئین¬های دخیل در ساختار و مکانیابی پروتئین¬های دیگر، پروتئین¬های دخیل در ساختمان سلولی و پروتئین¬های دخیل در رونویسی و ترجمه هستند. با اعمال تیمار شوری یا باکتری یا شوری و باکتری بیشترین تعداد لکه¬های دچار تغییر بیان شده مربوط به گروه پروتئین¬های متابولیکی/انرژی¬زایی بود.

کلزا یکی از گیاهان یکساله و روغنی مهم است. سالیانه مقادیر بالایی روغن خوراکی برای تأمین نیاز داخلی از خارج وارد می شود. یکی از مشکلات زراعت و تولید کلزا ریزش دانه است که باعث کاهش عملکرد آن به ویژه در مناطق نیمه خشک می گردد. چندین ژن که در باز شدن غلاف و ریزش دانه دخالت دارند شناخته شده اند. یکی از راهبردهای اصلاح مولکولی برای ایجاد لاین های گیاهی کلزای مقاوم به ریزش دانه کنترل این ژن ها از طریق خاموش نمودن آن ها به روش rnai می باشد. از جمله ژن های موثر در ریزش دانه در گیاه کلزا ژن bnshp از خانواده ژنی mads-box می باشد. در این پژوهش، سازه خاموشی rnai با استفاده از همسانه سازی دو قطعه مستقیم و معکوس توالی رمز کننده ژن bnshp به منظور توقف بیان این ژن، طراحی و ساخته شده است.