بتالاکتوگلوبولین (?-lg) پروتئینی از گروه پروتئین های لیپوکالین و پروتئین اصلی آب پنیر شیر گاو می باشد. ساختار ?-lg از دو پیوند دی سولفیدی و یک سیستئین آزاد در موقعیت 121 تشکیل شده است. عملکرد بیولوژیکی این پروتئین هنوز شناخته شده نیست، ولی نقشی بالقوه برای آن درحمل اسیدهای چرب در داخل دستگاه گوارش پیشنهاد شده است. ?-lg همچنین یکی از عوامل اصلی ایجاد حساسیت در شیر گاو است. حرارت دادن یکی ازمعمول ترین فن آوری هایی است که بشر برای تهیه محصولات لبنی استفاده می کند. علیرغم استفاده مکرر از حرارت دادن، هنوز هم آثار حرارت بر روی ?-lg و ساختار آن، بر روی چگونگی تشخیص آن توسط ige بیماران دارای آلرژی به شیر گاو، به طور کامل شناخته نشده است. ازآنجایی که ممکن است ?-lg در طی حرارت دادن، توسط قندهای کاهشی موجود در شیر بر اثر واکنش مایلارد اصلاح گردد، پروتئین های قنددار شده در حضور شش قند کاهشی تولید شدند. توصیف ساختاری پروتئین های اصلاح شده توسط حرارت و قنددار شدن با روش های مختلفی مانند cd و الکتروفورز انجام شد و نتایج قابل قبول حاصل از این روش ها نشان داد که اصلاحات ساختاری، باعث ایجاد تغییراتی در خواص آنتی ژنی یا واکنش پذیری ایمنی این پروتئین غذایی مهم خواهد داشت. تشکیل پیوند ige با ?-lg طبیعی و مقایسه آن با ?-lg حرارت داده شده در بیمارانی که به شیر گاو حساسیت داشتند در محدوده دمایی °c 95-65 به وسیله آزمایشات elisa مورد ارزیابی قرار گرفت. از دست رفتن ساختارهای دوم و سوم ?-lg توسط حرارت دادن در دماهای بالاتر از °c 75، منجر به کاهش احتمال شناسایی آن توسط ige شد که البته واکنش پذیری آن در بیماران مختلف متفاوت بود. همچنین پیوند شدن ige بیماران دارای آلرژی به شیر گاو و ?-lg های قنددار شده نیز اندازه گیری شد و کاهش پیوند شدن ige بر روی بتالاکتوگلوبولین های قنددار شده با درجه بالا، نیز مشاهده گردید. در طول این تحقیق تولید ?-lg نوع وحشی (wt) و ?-lg جهش یافته cys121ser با استفاده از مخمر pichia pastoris انجام شد. جهش cys121ser مانع از تجمع برگشت پذیر ?-lg بر اثر حرارت می شود. پیوند شدن ige بیماران دارای حساسیت به شیر گاو با ?-lg طبیعی، wt و جهش یافته cys121ser نیز توسط آزمایشات elisa اندازه گیری گردید. در بخش آخر این تحقیق، برهمکنش سروتونین و یکی از مشتقات آن، آراچیدونیل سروتونین (aa-5ht)، با ?-lg با استفاده از روش های دورنگ نمایی دورانی (cd) و اندازه گیری های شدت فلورسانس مورد بررسی قرار گرفت. ثابت تمایل تشکیل پیوندی برای برهمکنش ?-lg/5-ht بین 5 10 و m-1 6 10 است، درحالی که برای کمپلکس aa-5ht/?-lg بین 4 10 و m-1 5 10 است. این مقادیر با اندازه گیری های شدت فلورسانس به دست آمد. ثابت های تمایل تشکیل پیوندی در محیط هیدرواتانولی (25% اتانول) برای هر دو لیگاند بیشتر بود. برهمکنش های بین ?-lg/5-ht و aa-5ht/?-lg ممکن است با فرآیند اجتماع خود به خودی (تشکیل میسل) توسط لیگاند و نیز پروتئین رقابت کند. بر اساس نتایج حاصل از دورنگ نمایی دورانی فرابنفش نزدیک و دور، این لیگاندها هیچگونه اثر قابل توجهی بر ساختار دوم ?-lg ندارند، اما آنها به طور ویژه ساختار سوم بتالاکتوگلوبولین را ناپایدار می کنند. پیوند شدن این لیگاندها با ?-lg ممکن است یکی از مکانیسم های جانبی تنظیم مقدار سروتونین و مشتقاتش در حیوانات شیر خوار باشد.

خصوصیات عملکردی پروتئین ها بسیار وابسته به اندازه ، کنفورماسیون ساختاری ، توزیع و سطح بارهای یونی است. اصلاح پروتئینهای شیر نیز جهت افزایش یا تغییر خصوصیات عملکردی و زیست شناختی آن¬ها می¬تواند کاربرد آن¬ها را افزایش دهد. در این راستا مقالات متعددی مبنی بر القای فعالیت¬های جدید زیستی به پروتئین¬های شیر به چاپ رسیده که بواسطه اصلاحات شیمیایی، آنزیمی و ژنتیکی آن¬ها صورت گرفته است. از جمله آلفالاکتالبومین (?-la) که یک وپروتئین کوچک اسیدی متصل شونده به یون کلسیم است که تقریبا در شیر همه پستانداران یافت می¬شود و به طور طبیعی در تنظیم آنزیم لاکتاز سنتاز نقش دارد درحالی¬که فعالیت های جدید زیستی مانند فعالیت¬های ضدسرطانی و ضدویروسی ، حاصل تغییرات ساختاری آن مشاهده شده است. ازجمله این اصلاحات، واکنش استریفیکاسیون است که بواسطه افزایش بار خالص مثبت و آبگریزی پروتئین، سبب القای فعالیت ضدویروسی به پروتئین¬های شیر و القای فعالیت ضدباکتریایی به پروتئین¬های غلات شده است. باتوجه به اینکه هیچ¬گونه گزارشی مبنی بر فعالیت ضدباکتریایی مشتقات استری پروتئین های شیر ارائه نشده است، در این پژوهش، بررسی فعالیت ضد باکتریایی آلفالاکتالبومین استری شده مورد هدف واقع گردید. در این راستا، از طریق روش رسوب نمکی با آمونیوم سولفات، این پروتئین با خلوص 81% از شیر تازه تهیه گردید و به کمک الکل¬های مختلف تحت شرایط اسیدی و دمای 4 درجه مشتقات استری آن تهیه شد. از طریق یک واکنش رنگی ایجاد شده بوسیله هیدروکسیل¬آمین هیدروکلراید، میزان کمی پیشروی واکنش استریفیکاسیون مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان پیشرفت استریفیکاسیون برای متانول، اتانول، 1-پروپانول، 1-بوتانول و 2-پنتانول، به ترتیب 79/53%، 95/34%، 1/85%، 2/32% و 07/6%، بدست آمد. نتایج حاصل نشانگر نقش موثر عواملی چون مدت زمان واکنش، ماهیت الکل مورد استفاده، ماهیت پروتئین، مقدار آب موجود در محیط واکنش و نسبت مولی، در بازدهی واکنش استریفیکاسیون می¬باشد. سپس با استفاده از روش رایج دیسک آنتی بیوتیک مشخص شد که آلفالاکتالبومین تغییر یافته، هیچ اثر مهار رشدی برروی باکتری¬های گرم مثبت و گرم منفی ندارد. این موضوع می¬تواند به ویژگی¬های ساختاری و مکانیسم-های مهاری باکتری¬ها ، ساختارهای تصادفی بدست آمده از تغییر شیمیایی پروتئین و ماهیت پروتئین تغییریافته مرتبط باشد.

بتالاکتوگلوبولین (–lg?) یک پروتئین کروی شامل 162 اسید آمینه دارای وزن مولکولی 3/18کیلو دالتون فراوانترین پروتئین موجود در سرم شیر نشخوارکنندگان می¬باشد. –lg? دارای غلظت حدود gr/l 4-3 در شیر گاو می¬باشد. در ph فیزیولوژیک به صورت فرم دیمر است و به علت تشابه ساختار و توالی در خانواده لیپوکالین قرار گرفته است. ساختار –lg? با استفاده از اشعه ایکس مشخص شده و نشان می¬دهد، این مولکول شامل یک استوانه بتا (کالیکس) با هشت صفحه بتا موازی غیرهمسو، یک مارپیچ آلفا که کالیکس مرکزی را در برگرفته است. عملکرد زیستی این پروتئین به طور کامل شناخته نشده است. اگر چه این پروتئین قابلیت اتصال به بسیاری از لیگاندهای آبگریز مانند رتینول و اسید پالمتیک را دارا است. –lg? در واقع عامل اصلی حساسیت¬زایی، به خصوص در نوزادان می¬باشد. مطالعات بسیاری برای کاهش حساسیت¬زایی این پروتئین انجام شده است. هدف از این پژوهش بررسی میزان کاهش حساسیت¬زایی پروتئین بتالاکتوگلوبولین با ایجاد جهش¬هایی در ساختار زنجیره آمینواسیدی آن می¬باشد. به همین منظور جهش¬هایی در برخی از اپیتوپ¬های اصلی این پروتئین ایجاد شده است. پلاسمید مربوط به تولید پروتئین¬های جهش یافته به مخمر پیکیا پاستوریس تزریق شد و پس از تولید و خالص سازی پروتئین مورد نظر، خواص حساسیت¬زایی آن را با انجام آزمایش الایزا با پروتئین طبیعی مقایسه شد. از نتایج می توان نتیجه گرفت پیوند شدن کمتر ige به پروتئین¬های ?-lg جهش¬یافته نسبت به ?-lg طبیعی در افراد مبتلا به cma حاکی از کاهش حساسیت¬زایی با ایجاد جهش در اپیتوپ اصلی این پروتئین می¬باشد. در بخش بعدی ویژگی های اتصال رتینال به هر یک از –lg?های طبیعی و جهش¬یافته k69n با استفاده از روش uv-vis مقایسه شد نتایج بدست آمده نشان می¬دهد که ثابت اتصال رتینال به پروتئین طبیعی برابر (107 × 7/2)، در حالی که اتصال رتینال به نوع جهش¬یافته افزایش 3 برابری را نشان می¬دهد (107 × 1/8). به منظور بررسی محل اتصال رتینال از نرم¬افزار argus lab استفاده شد که نتایج حاصل از آن نشان داد، محل اتصال رتینال به lg? طبیعی و جهش¬یافته حفره کالیکس مرکزی است