نام پژوهشگر: مهسا یوسفی پور حقیقی

انتقال ژن به گونه های قارچ colletotrichum با استفاده از آگروباکتریوم تومیفشینس
پایان نامه وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - دانشگاه بوعلی سینا - دانشکده علوم کشاورزی 1390
  مهسا یوسفی پور حقیقی   [جلال سلطانی

قارچ ها در طبیعت به دلیل تولید آنزیم ها و متابولیت های اولیه و ثانویه ی بسیار مهم شان از موجودات بسیار مهم و پرکاربرد در صنعت، پزشکی و کشاورزی هستند. قارچ ها با روش های مختلف بیوتکنولوژیکی تحت دستورزی ژنتیکی قرار گرفته اند. بهترین روش توصیه شده برای دستورزی ژنتیکی قارچ ها روش انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم تومیفشینس شناخته شده است. قارچ کولتوتریکوم گلوسپوریویدس قارچی ملانکونیال و ریسه ای که به عنوان قارچ مولد تاکسول معرفی شده است.نخست, برای داشتن حداکثر میزان کنیدی در کمترین زمان جهت آزمایشات تراریختی این قارچ تحت تیمار های نوری، دمایی و محیط کشت قرار گرفت. در نتیجه این آزمایشات بهترین شرایط برای کنیدی زایی قارچ ترکیب محیط سیب زمینی دکستروز آگار و کاغذ فابریانو در دمای 25-30 درجه سانتی گراد و 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی بدست آمد و پس از 15 روز غلظت کنیدیایی حدود 105 کنیدی بر میلی لیتر را تولید کرد و پس از 30 روز غلظت کنیدیایی آن به 108 کنیدی بر میلی لیتر رسید. سپس قارچ مذکور به جهت بررسی میزان تراریختی و بررسی شرایط بهینه برای داشتن حداکثر تراریخت توسط آگروباکتریوم تومیفشینس سویه psdm دارای ژن گزینش گر مقاومت به هیگرومایسین b( hph )و سویه آگروباکتریوم تومیفشینس bs.y90 حاوی ژن گزارش گرپروتئین فلورسنت سبز( gfp) تحت دستورزی ژنتیکی قرار گرفت.نتایج بدست آمده بیانگر آنند که برایداشتن حداکثر تراریختی در این قارچ بهترین شرایط ترکیب شرایط 3 روز هم کشتی و غلظت کنیدیایی 107 کنیدی بر میلی لیتر و استفاده از فیلتر هم کشتی فابریانو برای هر دو تراژن بود. به طور کلی استفاده از فیلتر های حاوی نایلون برای ژن غیر فلورسنت hph مناسب تر بود وباعث تراریختی بیشتری شد.نتایج انتقال ژن و بیان پایدار تراژن ها با استفاده از کشت متوالی در محیط های غربال, واکنش زنجیره ای پلیمراز و فلورسنس میکروسکوپی به تایید رسید. قارچهای تراریخت حاصله از نظر فنوتیپ رویشی نیز تفاوتهای آشکار با والد تیپ وحشی خود نشان دادند.همچنین ژنوم این قارچ جهت تشخیص حضور ژنهای مسیر بیوسنتز تاکسول برای دو ژن انتهایی این مسیر بنام های dbat و bapt توسط pcr بررسی شد باند مربوط به ژن dbat مشاهده شد اما باند مربوط به bapt مشاهده نشد و hplc وجود ماده تاکسول را در عصاره متانولی خارج سلولی قارچ کشت شده در محیط کشت مایع pdb تایید نکرد