نام پژوهشگر: میترا رودگرنشتا
میترا رودگرنشتا آذر شاه پیری
تیوردوکسین ها (trxs) پروتئین هایی با وزن مولکولی کم هستند که با توالی آمینواسیدی wc(g/p)pc در جایگاه فعال قابل تشخیص می باشند. trx ها با کمک سیستئین های جایگاه فعال و از طریق احیای برگشت پذیر باند های دی سولفیدی در فرآیند های متعدد اکسیداسیون- احیا شرکت می کنند. برخلاف پستانداران، باکتری ها و قارچ ها، گیاهان دارای ایزوفرم های مختلفی از trx می باشند. ایزوفرم های مختلف trx در گیاهان بر اساس ساختار اولیه و مکان قرارگیری در سلول دسته بندی می شوند. تیوردوکسین های f، m، x و y در کلروپلاست ، trxo در میتوکندری و ایزوفرم های trxh در چندین اندامک سلولی واقع شده اند. در گیاهان عالی ایزوفرم های متعددی از trxh وجود دارند. در ژنوم برنج (oryza sativa)، نه ژن کدکننده ی trxh شناسایی شده است. همردیف سازی چندگانه بین این ایزوفرم ها، تفاوت قابل توجهی بین ایزوفرم ostrx20 و هشت ایزوفرم دیگر نشان داد. توالی جایگاه فعال این هشت ایزوفرم از موتیف عمومی جایگاه فعال trxها (wcg/ppc) تبعیت می کند در حالی که در جایگاه فعال ostrx20 آمینواسید gly/pro با thr جایگزین شده است. به علاوه در نزدیکی جایگاه فعال، در دیگر ایزوفرم های trxh، آمینواسید حفاظت شده ی asp حضور دارد که در ostrx20 با آمینواسید بازی lys جایگزین شده است. درتحقیق حاضر، برای مطالعه ی نقش حیاتی آمینواسید های حفاظت شده ی gly و asp در فعالیت احیایی trxh، با استفاده از روش موتاسیون زایی هدایت شده thr55 و lys48 به ترتیب با gly و asp در ostrx20 و gly41 با thr در ostrx23 جایگزین شدند. به این منظور و بر اساس این روش واکنش pcr با استفاده از ناقل pet-15b حاوی ژن کدکننده ی ostrx20 طبیعی- به عنوان ماده ی اولیه ی ژنتیکی- انجام شد. محصول pcr بعد از تیمار با آنزیم dpni به باکتری ecoli سویه ی dh5? منتقل شد. بعد از تأیید موتاسیون زایی با استفاده از توالی یابی و هضم آنزیمی به کمک آنزیم برشی مناسب، پلاسمید های حاوی ژن جهش یافته به باکتری e.coli سویه ی rosetta (de3) انتقال داده شدند. پروتئین های جهش یافته ی نوترکیب ostrx20(t55g)، ostrx20(k48d)، ostrx20(t55g)(k48d) و his6-ostrx23(g41t) پس از القای iptg در فاز محلول تولید شدند. پروتئین های نوترکیب موجود در فاز رویی به روش کروماتوگرافی جذبی و با استفاده از ستون های his-trap خالص سازی شدند. ایزوفرم های trxh جهش یافته ی نوترکیب نیز مانند پروتئین طبیعی از نظر توانایی احیای انسولین- سوبسترای عمومی trx - درphهای مختلف بررسی شدند. به علاوه قابلیت احیای جهش یافته ها توسط osntr1 آزمایش و با پروتئین طبیعی مقایسه شد. نتایج نشان داد که فعالیت ostrx20(wt) در پاسخ به تغییرات ph پایدار نبوده در حالی که جهش یافته های ostrx20(t55g)، ostrx20(k48d) و ostrx20(t55g)(k48d) در برابر این تغییرات پایدار بودند. مطابق با این، جایگزینی gly41 با thr در ایزوفرم ostrx23، منجر به از دست رفتن پایداری ostrx23 در phهای مختلف شد. به علاوه نتایج نشان داد که جایگزینی thr55 با gly و lys48 با asp، تاحدودی باعث بهبود برهم کنش osntr1 و ostrx20 شد. بر این اساس برهم کنش osntr1 و ostrx23 نیز با جایگزینی gly41 با thr به مقدار قابل ملاحظه ای کاهش پیدا کرد. به منظور مطالعه ی نقش cysهای انتهای آمینو در ostrx20 و ostrx23، هرکدام از cysها با ser به روش موتاسیون زایی هدایت شده جایگزین شد. نتایج نشان داد درحالی که پروتئین های ostrx20(wt) و ostrx23(wt) به صورت مخلوطی از فرم مونومر و دایمر حضور دارند، جهش یافته ها ی ostrx20(c3s)(c4s) و ostrx23(c11s) تنها به فرم مونومر دیده شدند. فعالیت احیایی جهش یافته ها در واکنش با انسولین نیز تقریباً مشابه با پروتئین طبیعی بود. این نتایج نشان می دهد که cys3 و cys4 درانتهای آمینوی ostrx20 و cys11 درانتهای آمینوی ostrx23، نقشی کلیدی در دایمر شدن این پروتئین ها از طریق تشکیل باند های دی سولفیدی دارند.