بررسی اثر فاکتورهای محیطی از قبیل دما، ph، قدرت یونی و دناتورانت شیمیایی بر تجمع آمیلوئیدی لیزوزیم

بررسی اثر فاکتورهای محیطی از قبیل دما، ph، قدرت یونی و دناتورانت شیمیایی بر تجمع آمیلوئیدی لیزوزیم پایان نامه کارشناسی ارشد معصومه ولی پور استاد راهنما: دکتر سعید عمادی تیر 1390 تقدیم به پدر و مادر مهربان و فداکارم تشکر و قدردانی خدایا تو را سپاس می گویم به پاس هر آن چه برایم مقدر کردی. از استاد ارجمند و معلم بزرگوارم جناب آقای دکتر عمادی که طی مراحل تحقیق و تدوین پایان نامه همراه و راهنمای من بودند نهایت سپاس و قدردانی را دارم. از اساتید محترم خانم دکتر لیلا حسنی، آقای دکتر فرشید محمدرفیعی، آقای دکتر سید نادر سیدریحانی، آقای دکتر حسین فضلی و آقای دکتر محمد کتب علی سپاسگزارم. از دوستان صمیمی و عزیزم خانم ها فرزانه خلجی، مهسا کلهر، میترا نعمتی، صغری جلیلی، مریم خدابنده، بهاره شکیبا، سمیه غلامی و زهرا زند به خاطر محبت های بی دریغشان متشکرم. از دوستان خوبم در گروه بیوشیمی و بیوفیزیک، شیمی و فیزیک به خاطر تمام کمک هایشان ممنونم. از گروه شیمی تجزیه دانشگاه تحصیلات تکمیلی علوم پایه زنجان که امکان استفاده از دستگاه طیف سنج فلورسانس را برای ما فراهم کردند، از بخش فیزیک دانشگاه صنعتی شریف که امکان تصویربرداری میکروسکوپ اتمی را برای ما فراهم کردند و از مرکز تحقیقاتی بیوشیمی- بیوفیزیک دانشگاه تهران که امکان طیف گیری دورنگ نمایی دورانی را برای ما فراهم کردند تشکر می کنم. از جناب آقای دکتر حجت اله ولی که در زمینه تهیه تصویرهای میکروسکوپ الکترونی انتقالی با ما همکاری فراوانی داشتند نهایت تشکر را دارم. در پایان از تک تک اعضای خانواده ام و به ویژه پدر و مادر عزیزم که مایه دلگرمی من بودند صمیمانه تشکر می کنم. چکیده پدیده تجمع پپتیدها و پروتئین ها از مسائل مهم در پژوهش های زیستی است و در این راستا مطالعه تجمع های آمیلوئیدی، که مشاهدات متعدد حاکی از نقش تعیین کننده آن ها در بروز بیماری های تحلیل عصبی است، اهمیت بسیاری دارند. علی رغم بررسی های گسترده بر روی نحوه تشکیل تجمع های آمیلوئیدی هنوز جزئیات مکانیسم آن ناشناخته است. لیزوزیم انسانی (hul) یک پروتئین مستعد تشکیل آمیلوئید است که سویه های جهش یافته آن در بیماری آمیلوئیدوزیس سیستمیک وراثتی نقش مهمی دارند. از آن جا که لیزوزیم سفیده تخم مرغ (hewl) و hul از نظر ساختار و توالی شباهت زیادی دارند، در این مطالعه از hewl به عنوان یک مدل پروتئینی استفاده شد. در این پروژه ما اثر شرایط محیطی مختلف بر روی تشکیل تجمع های آمیلوئیدی در hewl را به کمک روش های سنجش فلورسانس، اسپکتروسکوپی دورنگ نمایی دورانی، میکروسکوپ نیروی اتمی و میکروسکوپ الکترونی انتقالی بررسی کردیم. ابتدا شرایط مورد نیاز برای تشکیل تجمعات آمیلوئیدی hewl تامین شد: 2 ph، دمای 54 درجه سانتی گراد، غلظت 2 میلی گرم در میلی لیتر از hewl و 24 ساعت انکوباسیون. سپس اثر تغییر در فاکتورهای محیطی فیزیکی( ph، درجه حرارت و قدرت یونی) و شیمیایی (دناتوره کننده هایی نظیر اوره و گوانیدین هیدروکلراید) را بر روی تجمع آمیلوئیدی hewl بررسی کردیم. در این مطالعه دماهای 37، 45، 54 و 70 درجه سانتی گراد را بررسی کردیم. نتایج بدست آمده نشان می دهند که تشکیل فیبریل های آمیلوئیدی hewl در دماهای نزدیک و یا بالاتر از دمای باز شدن پروتئین اتفاق می افتد که در این مورد دمای 54 و 70 درجه سانتی گراد بود. ph های مورد مطالعه 2، 4، 7 و 8 است و تشکیل فیبریل های آمیلوئیدی فقط در 2 ph رخ داد. اثر قدرت یونی را در محدوده 1/0، 3/0 و 5/0 میلی مولار کلرید سدیم بررسی کردیم. موثرترین غلظت یونی برای تشکیل تجمع های آمیلوئیدی 3/0 میلی مولار نمک کلرید سدیم بود. علاوه بر این اثر دناتوره کننده های اوره و گوانیدین هیدروکلراید را در دو غلظت 5/0 و 6 مولار بررسی کردیم. در حضور اوره فیبریل تشکیل نشد اما در حضور 6 مولار گوانیدین هیدروکلراید فیبریل مشاهده شد. ازآن جهت که مطالعه ما اثر فاکتورهای محیطی مختلف را بر روی تجمع آمیلوئیدی hewl نشان می دهد، نه تنها دارای اهمیت مکانیسمی است بلکه می تواند از اهمیت کاربردی در درمان موثرتر بیماری های تحلیل عصبی و سیستمیک برخوردار باشد.