آنالیز فیلوژنتیکی جدایه های ویروس کوتولگی زرد کدوییان و ارزیابی مقاومت توده های بومی و امکان ایجاد مقاومت مشتق از بیمارگر نسبت به آن در خربزه

بیماری های زردی ناشی از ویروس های قابل انتقال با سفیدبالک در مزارع کشت کدوییان و گلخانه اهمیت زیادی داشته و به کدوییان مناطق وسیعی از جهان خسارت زیادی وارد می کنند. دو کراینی ویروس قابل انتقال با سفید بالک cysdv و ccyv از عوامل ایجاد کننده زردی در کدوییان هستند. اگرچه cysdv از استان بوشهر گزارش شده، اطلاعات جامعی از وجود آن در سایر مناطق کشت کدوییان ایران وجود ندارد. از این رو در این تحقیق پراکنش جغرافیایی و تنوع ژنتیکی این ویروس تعیین شد. علاوه بر این وقوع سایر ویروس های عامل زردی بررسی شد. با استفاده از آزمون انتقال ، rt-pcr و تعیین توالی، ccyv در برخی مناطق کشت کدوییان در ایران تشخیص داده شد و رابطه مولکولی این ویروس با cysdv و سایر کراینی ویروس ها بررسی شد. همچنین در این تحقیق واکنش برخی توده های بومی خربزه به cysdvمورد بررسی قرار گرفت. با توجه به منابع نادر مقاومت به cysdv در خربزه و خیار در این مطالعه بیان موضعی سازه های ایجاد کننده ساختارهای سنجاق سری جهت القاء مقاومت در خربزه و خیار مورد ارزیابی قرار گرفت. در این تحقیق 366 نمونه شامل خربزه ، خیار ، خیار چنبر و کدو دارای علائم ویروس کوتولگی زرد کدوییان از 10 استان، با استفاده ازآزمون غیرمستقیم elisa با آنتی بادی cysdv مورد ارزیابی قرار گرفتند و آلودگی نمونه ها توسط آزمون rt-pcr تایید شد. نتایج نشان دهنده آلودگی 309 نمونه از 366 نمونه به cysdv بود. این ویروس در بسیاری مناطق جنوبی و مرکزی ایران شناسایی شد. توالی ژن رمز کننده پروتئین پوششی جدایه های ایرانی cysdv تعیین و آنالیز فیلوژنتیکی انجام شد. درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده به روش نزدیک ترین همسایه (neighbor joining) نشان داد که جدایه های ایرانی تشکیل یک خوشه داده و در زیر گروه شرقی قرا می گیرند. زیر گروه شرقی cysdv به دو زیر شاخه مجزا شامل جدایه های ایران وجدایه های عربستان تفسیم شدند. تشابه میان جدایه های ایرانی بیش از 99 درصد بود. میانگین فاصله ژنتیکی جدایه های ایران 008/0 و 004/0 به ترتیب در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی بود و مقایسه توالی cp cysdv نشان دهنده مقدار متغیری از dn-ds بین 75/2- تا 04/1 بود. مقدار dn-ds در اکثر موقعیت ها منفی بود که نشان دهنده نقش انتخاب منفی در تکامل پروتئین پوششی cysdv بود. آنالیز فیلوژنتیکی نشان دهنده تنوع ژنتیکی پایین جدایه های بود. استفاده از آغازگر اختصاصی ccyv در آزمون rt-pcr منجر به تکثیر قطعه مورد انتظار در نمونه های ایوانکی و برخی نمونه های ورامین و بوشهر شد. این اولین گزارش از وقوع آلودگی ccyv در ایران است. توالی ژن رمز کننده پروتئین پوششی جدایه های ایرانی ccyv تعیین و آنالیز فیلوژنتیکی انجام شد. میانگین فاصله ژنتیکی جدایه های ccyv تمام مناطق جهان بر اساس توالی آمینواسیدی cp 055/0 بود. درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده به روش نزدیک ترین همسایه (neighbor joining) نشان داد که جدایه های ccyv در دو گروه قرار می گیرند، گروه i شامل جدایه های چین، لبنان، ژاپن، سودان و تایوان و گروه ii شامل جدایه های ایران. در بین جدایه های ایران، جدایه ایوانکی از سایر جدایه ها متفاوت بود و در گروهی مجزا از جدایه های بوشهر و ورامین قرار گرفت. درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده بر اساس توالی آمینو اسیدی پروتئین پوششی به روش نزدیک ترین همسایه (neighbor joining) نشان داد که جدایه های ccyv رابطه نزدیک با lcv دارند و ccyv، cysdv، lcv و bnydv در یک گروه قرار گرفتند در حالی که bpyv که عامل بیماری زردی در کدوییان بوده و علایم مشابه ccyv و cysdv در گیاهان تیره کدو ایجاد می کند در گروه دیگری قرار گرفت. بکارگیری واریته های مقاوم بهترین راه مدیریت خسارت ناشی از ویروس ها است. در تحقیق حاضر واکنش 25 توده بومی خربزه و طالبی (cucumis melo) جمع آوری شده از مناطق مختلف ایران تحت شرایط مایه زنی کنترل شده به جدایه بوشهر cysdv ارزیابی شدند. مایه زنی بوته ها در مرحله سه برگی توسط سفید بالک bemisia tabaci حامل ویروس انجام و واکنش نمونه های فوق بر اساس میانگین شدت شاخص بیماری 8 هفته پس از مایه زنی، زمان ظهور علایم (درصد آلودگی 20 روز پس از مایه زنی) و میانگین جذب در آزمون الیزا 8 هفته پس از مایه زنی مورد ارزیابی قرار گرفت. تنها دو نمونه چروک زرد و تیل زرد تاخیر در ظهور علایم، شاخص شدت بیماری پایین و میزان جذب پایین در آزمون الیزا نشان دادند و بر این اساس مقاوم به ویروس و متحمل به بیماری قلمداد شدند. در این تحقیق برای بررسی امکان ایجاد مقاومت از طریق مقاومت پاتوژن زاد (مقاومت ناشی از خاموشی آر ان ای) ازorf1b که ژن رمز کننده rdrp و orf3 که کد کننده مهار کننده خاموشی آر ان ای (vsr) می باشد سه سازه مورد استفاده قرار گرفت. در سازه c1 که به عنوان شاهد مورد استفاده قرار گرفت هیچ ترادفی از cysdv وجود نداشت. سازه c2 بخشی از ترادف های rdrp و vsr ویروس کوتولگی زرد کدوییان در جهت سنس، سازه c3 بخشی از ترادف های rdrp و vsr به صورت سنس- اینترون- آنتی سنس داشت. سازه ها به نحوی طراحی شدند که محصول ترانویسی سازه c2 به صورت mrna تک رشته ای و محصول ترانویسی سازه c3 ام آر ان ایی خواهد بود که ساختار سنجاق سری تشکیل می دهد. این سازه ها ابتدا در حامل hannnibal ساخته شد و سپس به حامل pfgc5941 که یک حامل برای بیان ژن در گیاه است منتقل شد. در مورد c3 علاوه بر این به حامل part27 نیز منتقل شد. این سازه ها در گیاه با استفاده از روش تراریختی موضعی ( تزریق اگروباکتری با سر نگ به بافت برگ) مورد ارزیابی قرار گرفتند. ارزیابی بر اساس ظهور علایم و میانگین جذب در آزمون الیزا 4 هفته پس از مایه زنی انجام شد. آلودگی 100 در صدی پس از مایه زنی ویروس با استفاده از سفید بالک (b. tabaci) در گیاهان تزریق شده با هر سه سازه مشاهده شد. اگرچه در برخی گیاهان تزریق شده با سازه c3 مقدار جذب در آزمون الیزا مقداری کمتر از سایر گیاهان بود با اینحال در آزمون آماری اختلاف معنی داری بین سازه های مختلف مشاهده نشد. بر اساس نتایج به دست آمده در این پژوهش به نظر می رسد بیان موضعی بخشی از متوقف کننده خاموشی آر ان ای (vsr) در کنار بخشی از ژن rdrp تاثیری در ایجاد مقاومت به ویروس نداشت.