کلون کردن و آنالیز توالی یک ژن پروتئازی از باکتری serratia sp. strain f1390 و بیان آن در e. coli

در پژوهش حاضر ژن smp کد کننده یک پروتئازاسیدی با استفاده از تکنیک pcr از سویه بومی 1390 f serratia sp. strain جداسازی و در باکتری e. coli کلون گردید. ابتدا برپایه توالی dna متالوپروتئازهایی از سراشیا e-15 و sm6، پرایمر مناسب طراحی و ژن smp تکثیر گردید. سپس این قطعه 1515 جفت بازی در حامل petblue-2 وارد و در باکتری e. coli کلون گردید. آنالیز توالی ژن smp یک ژن متالوپروتئازی با طول 504 اسید آمینه را نشان داد .به منظور افزایش بیان پروتئاز، قطعه کامل ژن smp در وکتور بیانی pet 22b که حاوی پروموتور t7می باشد،کلون گردید و به داخل سلول های bl21(de3) انتقال یافت. اگرچه یک توالی نشانه در ژن کلون شده وجود دارد اما پس از القاء e.coli حاوی پلاسمید نوترکیب با iptg، هیچ فعالیت پروتئازی در محیط کشت باکتری مشاهده نشد. آزمایشات تکمیلی نشان داد که پروتئاز smp تنها در فراکشن داخل سلولی باکتری نوترکیب مشاهده می گردد. انجام آزمایشات بررسی خصوصیات بیوشیمیایی بر روی عصاره آنزیمی نشان داد که پروتئاز smp نوترکیب ph و دمای بهینه ی به ترتیب 0/5 و ?c 40 را دارا می باشد که در مقایسه با فرم وحشی آنزیم کمی متفاوت است. این آنزیم به شدت توسط edta 5 میلی مولار مهار می شود و بنابراین همانند پروتئازهای خانواده serralysin جزء متالوپروتئازها طبقه بندی می گردد. مطالعه عملکرد لخته کنندگی شیر پروتئاز نوترکیب نیز قابلیت مناسب این آنزیم را در تولید پنیر نشان می دهد.