جداسازی و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی پروتئاز شیرابه گونه ای از فرفیون (euphorbia heteradena

پژوهش حاضر با هدف جداسازی پروتئاز از شیرابه گیاه فرفیون هترادنا و بررسی برخی خصوصیات بیوشیمیایی آن، انجام شد. گیاه فرفیون از یک مزرعه انگور در اطراف شهر شیراز واقع در استان فارس، جمع-آوری شد. این گیاه با شماره سند 25056 در هرباریوم دانشگاه شیراز نگه داری می شود. بخش پروتئینی شیرابه توسط بافر سدیم استات 0/5ph~ از بخش غیر پروتئینی آن جدا شد. به منظور خالص سازی، سوپ آنزیمی پس از دیالیز در بافر مشابه، بروی ستون تعویض کاتیونی sp-sepharose قرار گرفت. از این ستون چهار پیک پروتئازی با نام های f1، heteradenins2، heteradenins3، heteradenins4 جداسازی شد. پروتئین f1 به دلیل داشتن مقدار پروتئین و فعالیت بیشتر، برای مراحل بعدی تخلیص انتخاب گردید. به منظور خالص سازی بیشتر پروتئین مورد نظر، از ستون آبگریز phenyl sepharose استفاده شد. از این ستون دو پروتئاز به نام های heteradenins1p1 و heteradenins1p2 جدا سازی شدند. مقدار ph بهینه برای آنزیم-های جدا سازی شده از ستون sp-sepharose با نام های heteradenins2، 0/10 و برای دو آنزیم heteradenins3 و heteradenins4، 5/9 می باشد. بهینه دما برای دو آنزیم heteradenins2، heteradenins3، ?c 65 و برای آنزیم heteradenins4، ?c 60 تعیین شد. پایداری دمایی آنزیم heteradenins2، heteradenins3 و heteradenins4 در دمای ?c 65 بوده و در دمای ?c 70، به ترتیب 34%، 32% و 13% از فعالیت خود را پس از گذشت یک ساعت انکوبه، حفظ کرده اند. بر اساس نمودار هانس ولف km آنزیم های heteradenins2، heteradenins3، heteradenins4 به ترتیب µm 54/99، µm 52/54، µm 30/63 و vmax آن ها به ترتیب µm/min 0567/0، µm/min 0371/0، µm/min 0336/0 با استفاده از سوبسترای کازئین تعیین گردید. همچنین در این مطالعه خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم های جداسازی شده از ستون آبگریز phenyl sepharose نیز مورد بررسی قرار گرفتند. آنزیم heteradenins1p1 در 0/11ph~ و آنزیم heteradenins1p2 در 5/10ph~ فعالیت بهینه دارند. همچنین آنزیم های heteradenins1p1 و heteradenins1p2 در دمای?c 65 از بیشترین میزان فعالیت برخوردار هستند. این دو آنزیم نیز در دمای ?c 65 پایدار بوده و پس از قرار دادن آن ها در دمای ?c 70 به مدت یک ساعت، به ترتیب میزان 97% و 63% از فعالیت آنها باقی مانده است. همچنین بر اساس نمودار هانس ولف km آنزیم های heteradenins1p1 و heteradenins1p2 به ترتیب µm 12/80 ، µm 70/98 و vmax آن ها µm/min 0510/0 و µm/min 0498/0 می باشد. بر پایه اطلاعات بدست آمده از حرکت الکتروفورتیک این دو پروتئاز بر روی ژل sds-page و native-page و همچنین خصوصیات بیوشیمیایی آن ها، به نظر می رسد که این دو پروتئاز به واسطه الگوی گلیکوزیلاسیون متفاوت، تاخوردگی مختلفی داشته و سطوح هیدروفوب در دسترس متفاوتی را از خود نشان می دهند.