بیوماس لیگنوسلولزی فراوانترین ترکیب آلی بر روی زمین بوده و با توجه به چشم انداز اتمام سوختهای فسیلی و بازار متغیر انرژی، به منظور تامین سوخت مایع حمل و نقل بسیار مورد توجه قرار دارد. هیدرولیز آنزیمی سلولز به مخلوطی از آنزیم های اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز یا سلوبیوهیدرولاز (نوع i و ii) و بتاگلوکوزیدازها نیاز دارد. از آنجایی که فرآورده های گلوکز و سلوبیوز مهارکننده های قوی در هیدرولیز آنزیمی سلولز هستند، ترکیب مراحل ساکاریفیکاسیون و تخمیر که معمولا در مخمرها صورت می گیرد، می تواند به عنوان راهبردی در هیدرولیز موثر سلولز و تبدیل آن به اتانول باشد. پژوهش حاضر نیز جهت تولید سلوبیوهیدرولاز نوع ii مقاوم به حرارت از اکتینومیست thermobifidia fusca با نام cel6b در pichia pastoris به صورت خارج سلولی انجام شد. هم چنین بیان این آنزیم در باکتریescherichia coli نیز با سازه اهدا شده توسط دیوید بی ویلسون از دانشگاه کرنل با نام psz143 بررسی و مقایسه شد. به منظور بیان در مخمر، ژن سلوبیوهیدرولاز cel6b موجود در سازه psz143، با واکنش pcr تکثیر و در نهایت به درون ناقل مخصوص مخمری، ppicz?a ، همسانه سازی شد. سازه نوترکیب حاوی ژن cel6b و توالیهای سیگنال ?-factor، c-myc و 6xhis tag، پس از انتقال به باکتری jm109 e. coli و انتخاب باکتری های نوترکیب از روی محیط کشت lb دارای µg/ml5/0 بلئومایسین، تکثیر شد. سازه نوترکیب پس از خطی شدن، با استفاده از الکتروپوریشن به سویه های gs115 و km71h مخمر p. pastoris منتقل شد. تراریخته های مخمری پس از 3 روز رشد، از روی ظروف ypds دارای µg/ml 100 زئوسین انتخاب شدند. هرکلنی پس از رشد در محیط کشت bmgy تا od600=2، به محیط کشت بیانیbmmy دارای یک درصد متانول، تلقیح شد. بهترین کلنی از نظر فعالیت سلوبیوهیدرولاز بر روی سوبسترای پنبه پیش تیمار شده فسفریک اسیدی (pc) و روش dns انتخاب شد. سپس بهترین غلظت متانول و بهترین روز بیان آنزیم نیز با روش dns تعیین شد. در نهایت نتایج نشان داد که سلوبیوهیدرولاز cel6b در سازه psz143 ، در باکتری به صورت داخل سلولی سنتز می شود که علت آن توالی سیگنال طبیعی این ژن است که مربوط به باکتری گرم مثبت t. fusca است که نمی تواند در باکتری گرم منفی (e. coli bl21(de3 باعث ترشح این آنزیم به محیط کشت شود. نتایج بیان در مخمر نشان داد، بیشترین میزان فعالیت سلوبیوهیدرولاز نوترکیب در محیط کشت، بر حسب مقدار سلوبیوز تولید شده در سویه های gs115 و km71h ، بر روی pc در دمای c° 50 و به مدت 16 ساعت، به ترتیب 98/1 و u(?mol/min)/ml 475/0 می باشد که این میزان در مقایسه با فعالیت آنزیم تولید شده در باکتری به مراتب کمتر است. فعالیت آنزیم نوترکیب تولید شده مربوط به کلنی های مخمری مورد بررسی کم بود که می تواند به علت عدم بهینه سازی توالی ژنی آنزیم در مخمر باشد. نمونه مربوط به کلنی پر محصول سویه gs115 بر روی ژل sds-page بارگزاری و بیان آنزیم تایید شد و سپس نتایج بهترین غلظت متانول و بهترین روز بیان آنزیم با همین سویه، در روز چهارم بعد از القا با 3 درصد متانول (v/v) به دست آمد. به علت اینکه توالی ژن cel6b برای بیان در یوکاریوت بهینه نشده بود، ممکن است توالی همسانه شده در وکتور مخمری حاوی کدون هایی باشد که به ندرت در p. pastoris استفاده می شود و یا اینکه عناصر محدود کننده بیان در داخل توالی کد کننده حضور داشته باشند، که می تواند از دلایل فعالیت کمتر این سلوبیوهیدرولاز در مخمر p. pastoris باشد.

آنزیم گلوتاتیون ‏‎-s‎‏ ترانسفراز‏‎(gst)‎‏ نقش بسیار مهمی در کونژوگاسیون مواد سمی و بیگانه با گلوتاتیون دارد که اولین مرحله در مسیر سمزدایی مرکاپتوریک اسید محسوب می شود. علاوه بر آن برخی کلاسها این آنزیم از جمله ‏‎gst-a‎‏ خاصیت گلوتاتیون - پراکسیدازی داشته مصرف گلوتاتیون احیا و به حفاظت سلولها در برابر واکنشهای اکسیداتیو کمک می کنند. تئوفیلین دارویی است که در درمان آسم مصرف گسترده ای دارد. مطالعات گذشته نشان داده است که تجویز دوزهای بالاتز از 50 میلی گرم بر کیلوگرم تئوفیلین باعث کاهش غلظت (‏‎gsh‎‏ و افزایش اکسیداسیون چربیها در کبد رتهای بالغ می شود. در این مطالعه تئوفیلین با دوز 50 میلی گرم بر کیلوگرم به هر دو گروه سنی رتهای بالغ و نوزاد تجویز شد. نمونه برداری در مغز حیوانات در فواصل 4، 8، 12، 16، 20 و 24 ساعت پس از تزریق دارو انجام شد. پس از تهیه سینوزول بافت، غلظت پروتئین و ‏‎gsh‎‏، فعالیت (gst) سیتوزولی و میکروزومی اندازه گیری شد. در مرحله بعد آنزیم (gst) سیتوزوولی با روش افینیتی کروماتوگرافی تخلیص و الگوی الکتروفورزی آنها بر روی ژل پلی اکریل آمید بررسی شد. نتایج حاصل نشان می دهد که 16 - 12 ساعت پس از تجویز تئوفیلین، در مغز نوزادان فعایت ویژه (gst) سیتوزولی تا دو برابر و (gst) میکروزومی تا 4 برابر مقدار هریک در گروه شاهد نوزادان افزایش می یابد و در همین زمان غلظت ‏‎gsh‎‏ به حداقل مقدار رسیده و سپس افزایش می یابد. اما فعالیت ویژه (gst) سیتوزولی و میکروزومی در مغز بالغین تغییر معنی داری را نشان نمی دهد. غلظت ‏‎gsh‎‏ در مغز بالغین 4 ساعت پس از تجویز تئوفیلین کاهش یافته ولی پس از 8 ساعت بازسازی می شود. در الگوی الکتروفورزی، کاهش ‏‎gst-n‎‏ و افزایش ‏‎gst-a‎‏ را در هر دو گروه سنی رتهای نوزاد و بالغ دیده می شود. با توجه به نقش ‏‎gst-a‎‏ وgst میکروزومی و ‏‎gsh‎‏ در خنثی کردن ارات ناشی از واکنشهای اکسیداتیو استرس، می توان نتیجه گرفت که این تغییرات به منظور مقایسه سلولها با اثرات اکسیداتیو ناشی تجویز تئوفیلین باشد. این تغییرات در مغز نوزادان شدیدتر بوده و علاوه بر تغییر الگوی ایزوآنزیمی، فعالیت ویژه آنزیم نیز افزایش می یابد که نشان دهنده القاپذیری برخی از ایزوآنزیمهای (gst) متناسب با نیازهای سلول برای سمزدایی و مقابله با آسیبهای سلولی است.