تجمعات آمیلوئیدی از جمله حالت های غیر طبیعی پروتئین ها می باشد که می تواند تحت شرایط مختلف از قبیل استرس اکسیداتیو و بالا رفتن میزان اسیدهای چرب غیر اشباع درون سلول ها ایجاد شود. مطالعات نشان می دهد که تشکیل این تجمعات با برخی از بیماری ها نظیر بیماریهای عصبی و سیستماتیک در ارتباط می باشند. بعنوان مثال آلزایمر و پارکینسون از جمله بیماری های تحلیل رونده عصبی هستند که به ترتیب در اثر تجمع پروتئین های بتا آمیلوئید و آلفا سینوکلئین ایجاد می شوند. بنابراین شناسایی مکانیسم های تشکیل و ایجاد مرگ سلولی توسط این ساختارها در جهت طراحی داروهای موثر امری بدیهی است. . در این مطالعه از دو پروتئین لیزوزیم و آلفاسینوکلئین جهت القای آمیلوئیدی شدن در شرایط آزمایشگاهی استفاده شد. اثرات سمیت ساختارهای آمیلوئیدی این پروتئین ها بر رشد سلول های sk-n-mc مطالعه شد. برای جلوگیری از تشکیل ساختارهای آمیلوئیدی از عصاره های گیاهی مختلفی استفاده شد که از این میانcuminum cyminum اثر مهاری بیشتری برهردو پروتئین داشت. اما این ترکیبات برای سلول ها سمی بودند. در مرحله بعد عصاره گیاهی با حلال های آلی جزئ به جزء شده و فرکشن های حلال تولوئن واتیل استات بیشترین تاثیر مهاری بر لیزوزیم داشتند اما بر آلفاسینوکلئین تاثیری نداشت بعلاوه کمترین اثرسمی را بر سلول ها دارا بودند.

در بیان و خالص سازی پروتئین های نوترکیب از توالی مکملی معروف به دنباله استفاده میشود که از انواع آنها می توان به his-tag، gst-tag، mbp-tag وstrep-tag اشاره نمود. وجود این توالیها موجب تسهیل وتسریع امر خالص سازی میگردد و در این میان his-tag پرکاربردترین این توالی هاست. در بسیاری از مواقع حضور این دنباله ها میتواند تاثیر منفی بر روی ساختار و عملکرد پروتئین داشته باشد اما در مطالعات معمولا این مسئله در نظر گرفته نمیشود. در این مطالعه به بررسی اثر حضور his-tag بر روی فرآیندهای فیبریلاسیون و سمیت سلولی آلفاسینوکلئین پرداخته شد و روش خالص سازی مناسب برای پروتئین بدون دنباله طراحی گردید. آلفاسینوکلئین پروتئین مونومری است که در سلولهای مغزی بیان میشود و نقش مهمی در بیماریهای تحلیل برنده سیستم عصبی ازجمله پارکینسون ایفا میکند و به همین دلیل مطالعات وسیعی برروی آن حتی درمدلهای برون تنی صورت میگیرد. آلفاسینوکلئین برچسبدار با هیستیدین در باکتری e.coli بیان شد و توسط کروماتوگرافی تمایلی خالص گردید. برای مقایسه، توالیhis-tag در وکتور توسط آنزیم های ndei و hindiii برش زده، حذف گشته و سپس در e.coli بیان شد و با بکارگیری روش متفاوت خالص سازی با کمک حرارت، خاصیت شلات کنندگی edta و رسوب دهی با ایزوپروپانول پروتئین بدون دنباله با خلوص بالای 95% خالص شد. در مرحله بعد فعالیت فیبریلاسیون هر دو پروتئین برچسب دار و بدون برچسب توسط تستهای استاندارد بررسی شد و تفاوت آن دو از نظر کینتیک تشکیل فیبریل مشخص گردید. his-tag باعث افزایش سرعت فیبریلاسیون می شود که این یافته توسط نتایج پیش گویی نیز ثابت شد. ازساعت های مختلف فیبریلاسیون هر دو پروتئین، نمونه برداری شد و به محیط کشت سلولی اضافه گردید و با تست mtt ثابت شد که نمونه 3 ساعته پروتئین his-tag دار و نمونه 7 ساعته آلفاسینوکلئین بدون his-tag بیشترین مرگ سلولی را دارند. این نتیجه نشان می دهد کهhis-tag باعث تسریع فیبریلاسیون می شود و قاعدتا مقدار بیشتری از سلول ها در نمونه 3 ساعته دچار آسیب می شوند اما همین نتیجه، برای نمونه 7 ساعته پروتئین بدون his-tag دیده می شود..

پساب رنگی صنایع، از جمله بخشهای آلاینده محیط زیست تلقی میگردند. 70 درصد رنگهای تجاری تولید شده رنگهای آزو هستند. اکثر این رنگها سمی و حتی سرطانزا میباشند که حذف آنها از پساب ضروری است. فرایندهای تصفیه متداول، برای رنگزدایی کامل پساب روش مناسبی نمیباشد و مستلزم صرف هزینه و زمان بالایی میباشند. روش جذب و انعقاد فرایند موثرتری برای حذف رنگها از محلولهای آبی، از نظر سادگی، کارایی بالا و اقتصادی بودن است.امروزه تحقیقات زیادی روی جاذب های جدید با بکارگیری پلیمرهای آلی طبیعی و سنتزی صورت می پذیرد. از تجمعات پروتئینی و نانوفیبریلهای پروتئینی میتوان بدلیل سازگاری با محیط زیست بعنوان یک بیوپلیمر و منعقد کننده طبیعی برای حذف رنگ از پساب صنایع استفاده کرد. در مطالعه حاضر، پس از تخلیص پروتئین لیزوزیم از سفیده تخم مرغ و القای فیبریلاسیون، نانو فیبریلهای لیزوزیمی، از نظر توانایی جذب زیستی هشت رنگ آزوی محلول، اسید رد 114، اسید رد 88، کرایزولیدین، بیسمارک براون آر، دایرکت ویولت 51، راکتیو بلک 5، راکتیو اورنج 16 و کنگورد بررسی شد. آزمونهای تعیین مشخصات پروتئین و فیبریل نشان داد که پروتئینی با درصد خلوص بالا بدست آمده و فیبریلهای آمیلوئیدی با ساختار صفحات بتا با قطر حدود 40 نانومتر تشکیل شده است. اثر دوز جاذب، ph، قدرت یونی و دمای محلول بر کارایی جذب بررسی گردید. حذف رنگها از محلول، توسط نانوفیبریلها به میزان غلظت نانوفیبریل وابسته بود اما رنگبری پایداری بالایی در دماهای متفاوت نشان می داد. ph اثر ویژه ای بر میزان رنگبری داشت و در حدود ph خنثی بهترین جذب انجام گرفت. همچنین افزایش قدرت یونی باعث کاهش رنگبری فیبریل شد. بر طبق نتایج بدست آمده، نانوفیبریلهای لیزوزیم توانایی رنگبری محلول آبی از رنگهای مورد تحقیق را داشته و می توانند بعنوان یک جاذب بیوپلیمری موثر برای حذف رنگهای آزو از پساب توسط فرایند انعقاد باشند.

تعداد قابل توجهی از بیماری های انسان از جمله بسیاری از اختلالات عصبی با تشکیل تجمعات پروتئینی پایدار، منظم و رشته ای که بنام فیبریل های آمیلوئیدی نامیده می شوند همراه است و بدین سبب به آنها بیماری های آمیلوئیدی گفته می شود. در این حالت یک پروتئین خاص یا بخشی از پروتئین از حالت محلول و طبیعی خود به فیبریل های نامحلول تغییر می یابد که در بافت ها و اندام های مختلف تجمع می یابند؛ بنابراین مطالعه پروتئین های آمیلوئیدی دخیل در این بیماری ها از اهمیت بالایی برخوردار است. فرم های آمیلوئیدی آلفاسینوکلئین یکی از ترکیبات اصلی تجمعات (لوئی بادی) درون سلول های دوپامینرژیک در بیماری پارکینسون است. این پروتئین می تواند به فضای خارج سلولی ترشح شود و با مکانیسم های مختلف به سلول گیرنده وارد شود و بیماری زایی را به سایر سلول ها منتقل کند. بر همین اساس در این مطالعه اثر سمیت این ساختارهای آمیلوئیدی را به صورت خارج سلولی بررسی کردیم. برای دستیابی به این هدف ابتدا فیبریلاسیون در پروتئین آلفاسینوکلئین القا گردید و سپس روند فیبریلاسیون با tht و قرمزکنگو دنبال گردید و تصاویر afm نیز جهت تائید صحت تشکیل فیبریل ها گرفته شد. همچنین نتایج cd نشان داد که پروتئین آلفاسینوکلئین در ابتدا بیشتر از ساختار پیچه ای نامنظم تشکیل شده بود ولی پس از القاء فیبریلاسیون ساختار آن حاوی مقادیر بالای صفحات بتا گردید. با تأیید تشکیل ساختارهای آمیلوئیدی مرگ سلولی ایجادشده توسط تجمعات فیبریلی با انجام mtt، ros، dna fragmentation، fura2-am و annexin v/pi بررسی گردید که نتایج نشان دهنده سمیت این ساختارهای آمیلوئیدی و ایجاد مرگ سلولی به واسطه آن ها بود. پس از انجام تست سلولی مسیرهای پیام رسانی درون سلولی که ممکن است با تیمار سلول ها با فیبریل ها آغاز شود مورد مطالعه قرارگرفت. ژن های مورد مطالعه مربوط به مسیر استرس شبکه آندوپلاسمی، اتوفاژی و هیپوکسی بودند که ژن های فعال در مسیر استرس شبکه آندوپلاسمی و اتوفاژی افزایش بیان داشته اند. بر اساس نتایج تست کلسیم که نشان داد فیبریل ها باعث افزایش ورود کلسیم به درون سلول می شوند می توان یکی از دلایل ایجاد استرس شبکه آندوپلاسمی را به برهم خوردن هموستازی کلسیم نسبت داد. یکی از عوامل خطر در سلول های دوپامینرژیک حضور خود دوپامین است. دوپامین در حالت سیتوزولی می تواند اکسیده شود و رادیکال های آزاد تولید نماید. از طرف دیگر آلفاسینوکلئین در تنظیم ذخیره سازی و ترشح دوپامین نقش دارند بنابراین اثر متقابل این دو ترکیب را در سلول های آسیب دیده نمی توان نادیده گرفت. از این رو در این مطالعه ما علاوه بر آلفاسینوکلئین، اثر دوپامین و اثر متقابل این دو را بر مرگ سلولی و همچنین وجود برهمکنش بین آن ها را ارزیابی کردیم.

در راستای رشد روزافزون علم نانوفناوری و کاربرد آن در دارورسانی، نانوذرات آلبومین به واسطه‏ی ویژگی زیست‏تخریب‏پذیری و غیر حساسیت‏زایی مورد توجه قرار گرفته‏اند. نانوذرات با توجه به دارا بودن نسبت سطح به حجم بالایشان تمایل زیادی به برهم‏کنش با مواد زیستی از قبیل پروتئین‏ها دارند، از این رو ممکن است در روند فیبریل‏شدن پروتئین‏ها اختلال ایجاد کنند و موجب مهار و یا تسریع آن شوند. تجمعات فیبریلی پروتئین آلفا-سینوکلئین به عنوان جزء اصلی تجمعات استخراج شده از مغز بیماران پارکینسون شناخته‏شده‏است. در پژوهش حاضر ابتدا نانوذرات آلبومین به روش‏ انحلال‏زدایی و با اندازه‏های مختلف و با به‏کارگیری انحلال‏زداهای مختلف تهیه و اندازه و بار آنها توسط آزمایش پراکنش پویای نور تعیین شد. پس از القای فیبریل‏شدن، روند فیبریل‏شدن و تشکیل فیبریل‏های آلفا-سینوکلئین با استفاده از آزمون‏های استاندارد نشر فلورسانس تیوفلاوین‏تی، طیف جذبی کنگوی قرمز، طیف دورنگ‏نمایی دورانی، تصاویر میکروسکوپ فلورسانس و میکروسکوپ نیروی اتمی بررسی شد. سپس، اثر حضور این نانوذرات با اندازه‏های مختلف بر روند فیبریل‏شدن پروتئین آلفا-سینوکلئین نانوذره و غلظت‏های مختلف آزمایش شد. مشاهدات حاکی از آن بود که نانوذرات آلبومین تاثیر معنی‏داری روی مقدار فیبریل‏های تشکیل شده ‏نداشتند منتهی منجر به کوتاه‏تر شدن مرحله‏ی هسته‏گذاری شدند. همچنین اثر حضور مونومرهای آلبومین بر فیبریل‏شدن آلفا-سینوکلئین مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد مونومرهای آلبومین منجر به افزایش زمان مرحله‏ی هسته‏گذاری شدند. در ادامه اثر حضور نانوذرات آلبومین بر فیبریل‏شدن پروتئین‏های لیزوزیم و انسولین مطالعه شد؛ اثر مهاری این نانوذرات بر فیبریل‏شدن این پروتئین‏ها بسیار محسوس‏تر از فیبریل‏شدن پروتئین آلفا-سینوکلئین بود.

عملکرد سلول های اپیتلیوم رنگدانه دار شبکیه (rpe) در حمایت و حفظ کارکرد سلول های گیرنده ی نوری ضروری است. ایجاد اختلال در عملکرد صحیح سلول های rpe می تواند موجب بیماری هایی نظیر رتینیت پیگمنتوزا (rp) یا تخریب وابسته به سن ماکولا (amd) شود. یکی از راه کارهای درمانی این دو بیماری پیوند سلول های rpe سالم در فضای آسیب دیده است. به منظور افزایش قدرت اتصال و بقا سلول ها، پیوندزدن سلول ها به همراه یک داربست ضروری است تا شرایط رشد و بقای سلول ها را فراهم کند. در این تحقیق، رشد سلول های rpe انسانی بر روی اشکال فیبریل های آمیلوئیدی پروتئین لیزوزیم بررسی شده است. پروتئین لیزوزیم به عنوان یک پروتئین مدل در مطالعات روند فیبریلاسیون به شمار می رود از این رو فیبریلاسیون پروتئین لیزوزیم در بافر اسیدی انجام شد و ویژگی های اشکال فیبریلی توسط رنگ های اختصاصی تیوفلاوین تی و کنگوی قرمز، میکروسکوپ فلورسنس، انتقال فوریه ی فروسرخ، طیف سنجی دورنگ نمایی دورانی، تصویربرداری میکروسکوپ نیروی اتمی و تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی نگاره ارزیابی شد. فیبریل های آمیلوئیدی ساخته شده قطری بین 23 تا 50 نانومتر داشتند و برای ساخت بستر نانوفیبریلی استفاده شدند. در نهایت سلول های rpe بر روی بستر کشت داده شدند و آنالیز های سلولی شامل سنجش میزان سمیت، میزان رشد سلولی، میزان ros سلولی و ریخت شناسی سلولی انجام شد. نتایج نشان داد رشد سلول ها در بستر نانوفیبریلی نسبت به پلیت کشت سلول مشابه است. از این رو بستر فیبریل های آمیلوئیدی با ریخت شناسی ارائه شده می تواند به عنوان یک کاندید مناسب در بررسی میانکنش های سلول-ماتریکس و کاربرد های پزشکی در آینده مطرح باشد.