بیان و تعیین خصوصیات آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز باکتریایی در مخمر پیکیا پاستوریس با هدف تجزیه نوروتوکسین های ارگانوفسفره

saeed najavand، department of clinical biochemistry, faculty of medical sciences, tarbiat modares university, tehran, iran abbass sahebghadam lotfi، 1- department of clinical biochemistry, faculty of medical sciences, tarbiat modares university, tehran, iran 2- department of animal and marine biotechnology, national institute of genetics engineering and biotechnology, tehran, iran afshin mohsenifar، assistant professor, department of toxicology, faculty of medical sciences, tarbiat modares university, tehran, iran sareh arjmand، department of animal and marine biotechnology, national institute of genetics engineering and biotechnology, tehran, iran ali mota، department of clinical biochemistry, faculty of medical sciences, tarbiat modares university, tehran, iran

چکیده

هدف: آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز آنزیم هومودیمری است که قادر به هیدرولیز پیوندهای فسفواستر و کاهش سمیت نوروتوکسین‏های ارگانوفسفره است. این خصوصیت آنزیم، ارگانوفسفر هیدرولاز را ابزار ارزشمندی برای تجزیه، تشخیص و زیست‏پالایی سموم ارگانوفسفره می سازد. مواد و روش ها: در این مطالعه ژن آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز باکتری سودوموناس دیمینوتا پس از بهینه‏سازی برای مخمر پیکیا پاستوریس و تبدیل آن به فرم ترشحی (آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز به فرم غشایی در باکتری وجود دارد) در ناقل بیانی ppiczαb کلون شد. پس از ترانسفورم و القای مخمرهای نوترکیب، آنزیم به لحاظ تجزیه سموم، تعیین پارامترهای بیوشیمیایی و سینتیکی ارزیابی شد. نتایج: آنزیم به میزان 49/7 مرتبه و با فعالیت ویژه 103 × 421/0 واحد در میلی‏گرم پروتئین و با بازده 33 درصد از محلول رویی محیط کشت، جداسازی و خالص سازی شد. آنزیم بهترین فعالیت و پایداری را تا دمای 50 درجه سانتی‏گراد و ph 7 تا 10 از خود نشان داد. با استفاده از سوبسترای پارااکسون، ثابت میکائیلیس (km) و حداکثر سرعت آنزیم (vmax) به‏ترتیب 96/45 میکرومولار و 23/11 میکرومولار در دقیقه محاسبه شد. آنزیم نسبت به کاتیون‏های دو ظرفیتی بسیار حساس بود و توسط عوامل واسرشته کننده نظیر سدیم دودسیل سولفات فعالیت خود را از دست داد. وزن مولکولی آنزیم با استفاده از الکتروفورز sds-page حدود 40 کیلودالتون تخمین زده شد. نتیجه‏گیری: بر اساس نتایج بررسی حاضر آنزیم به‏طور مؤثری سموم ارگانوفسفره نظیر پارااکسون را تجزیه می کند. فعالیت و پایداری در ph و دماهای بالا و همچنین پایین بودن ثابت میکائیلیس آنزیم نسبت به انواع باکتریایی، آن را کاتالیزگر زیستی مناسبی برای کاربردهای زیست‏پالایی و تشخیصی می سازد.