ساخت ناقل های نوترکیب حاوی ژن کدکننده پروتئین تنظیمی تولید آنتی بیوتیک استرپتومایسین، جدا شده از یک سویه استرپتومایسس گریزئوس ایرانی
چکیده
strr یک تنظیم کننده کلیدی در رونویسی خوشه ژنی بیوسنتز آنتی بیوتیک استرپتومایسین است. این پروتئین توسط ژن strr استرپتومایسس گریزئوس با طول 1053 جفت باز کد می شود. هدف این تحقیق، کلونینگ ژن strr از سویه استرپتومایسس گریزئوس ایرانی ptcc1127 و همچنین atcc1952 درناقل pma::hyg بود. برای این منظور پرایمرهای اختصاصی ژن strr با نرم افزار oligo طراحی شدند، قطعه با طول 1134جفت باز به روش pcr تکثیر شد. سپس با روش semi nested pcr و pcr-rflp محصول pcr تأیید و درناقل تداخلی pma::hyg مخصوص استرپتومایسس الحاق گردید. در واکنش الحاق، به دلیل به کارگیری دو جایگاه برش متفاوت bamhiو xbai در دو انتهای ژن strr و استفاده از همین دو جایگاه برش درناقل pma::hyg احتمال خودالحاقی (self ligation) ناقل pma::hyg وجود نداشت. در مرحله بعد، ناقل های نوترکیب ساخته شده به نام pspstrr (حاوی ژن strr مشتق از سویه ptcc1127) و psmstrr (حاوی ژن strr مشتق از سویه atcc1952) به سلول های مستعد باکتری e. coli xl1-blue ترانسفورم شدند. ساختار سازه های جدید توسط روش های مختلف مولکولی تایید گردید. از طرف دیگر ژن strr جدا شده در وکتور مولتی کپی و بیانی pbluescript نیز ساب کلون گردید. در آینده می توان از این ناقل های نوترکیب ساخته شده به عنوان ابزارهای مناسبی برای جهش زایی جهت دار شده در جایگاه (site directed mutagenesis) و استراتژی های جایگزینی ژن (gene replacement) در استرپتومایسس گریزئوس استفاده کرد. از طرف دیگر از پروتئین تولید شده در e. coli میتوان جهت القا و افزایش تولید آنتی بیوتیک در محیط کشت استرپتومایسس استفاده نمود. علاوه بر این می توان ژن strr را با واسطه یک ناقل بیانی مثل pmt3206 در میزبان استرپتومایسس گریزئوس کلون و اثر افزایش بیان این ژن تنظیمی را در افزایش میزان تولید آنتی بیوتیک استرپتومایسین بررسی کرد.