اندازه گیری آنتی بادی تولید شده علیه کپسول پلی ساکاریدی پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات استخراج شده از هموفیلوس آنفلوانزای تیپ b سویه ی محلی atf۲ با روش enzyme-linked immunosorbent assay (elisa)
Abstract
مقدمه: هموفیلوس آنفلوانزای تیپ b (hib یا haemophilus influenza b) یک ارگانیزم کپسول دار و عامل اصلی مننژیت در کودکان در جهان می باشد. آنتی ژن کپسول پلی ساکاریدی hib یک پلیمر تکراری از ریبوزیل ریبیتول فسفات و مهم ترین عامل ویرولانس و مسبب عفونت های بسیار در کودکان زیر 5 سال به خصوص کودکان زیر 2 سال می باشد. کپسول پلی ساکاریدی کانژوگه با یک حامل پروتئینی، در جلوگیری از چنین عفونت هایی بسیار مؤثر است. روش ها: در این مطالعه، hib سویه ی atf2 جدا شده از یک کودک مبتلا به مننژیت، در فرمانتور حاوی محیط اصلاح شده ی giolitti-cantoni broth (gc broth) کشت داده شد. کشت حاصل، بعد از غیر فعال شدن با استفاده از روش های مختلف تخلیص و آنتی ژن پلی ساکاریدی (prp یا polyribosylribitolphosphate) تهیه شده بعد از عبور از فیلتر 25/0 میکرومتری با توکسوئید کزاز (tt یا tetanus toxoid) به عنوان حامل پروتئینی کونژوگه گردید. محصول کونژوگه، پس از عبور از ژل سفارز cl-4b جداسازی شد و به عنوان محصول کونژوگه prp-tt مورد استفاده قرار گرفت. یافته ها: مقدار prp موجود در محصول کونژوگه 402 میکروگرم از 10 9 باکتری در هر میلی لیتر تخلیص شد. مقدار پروتئین و اسیدنوکلئیک موجود در prp مطابق با مقدار توصیه شده توسط world health organization (who) زیر 1 درصد بود. بازیافت prp موجود در محصول کونژوگه بعد از استفاده از sodium deoxycholate (doc)، 58 درصد بود که نشان دهنده ی مقدار بالای اتصال prp و پروتئین اولیه بود. پاسخ آنتی بادی علیه محصول کونژوگه (prp-tt) تهیه شده در نوزاد رت با نژاد ویستار با روش enzyme-linked immunosorbent assay (elisa) غیر مستقیم اندازه گیری و بالاترین تیتر برای محصول کونژوگه نسبت به prp استخراج شده در آزمایشگاه و prp استاندارد خریداری شده از مؤسسه ی بین المللی استانداردهای بیولوژی در لندن (national institute for biological standards and control یا nibsc) به دست آمد. در تیتر آنتی بادی به دست آمده برای prp تخلیص شده و خریداری شده از nibsc در غلظت برابر آنتی ژن و رقت 200/1 آنتی بادی شباهت زیادی دیده شد که این نشانگر خلوص prp تهیه شده در آزمایشگاه می باشد. نتیجه گیری: روش تخلیص prp، کونژوگاسیون و ایمنی زایی محصول کونژوگه در مدل حیوانی نوزاد رت روشی مقرون به صرفه و عملی با خلوص بالا است که می توان از آن درتولید واکسن hib با حجم بالا (scale up) استفاده کرد.