تولید سلولهای دندریتیک تولروژن موشی از طریق ممانعت از بیان مولکول های کمک تحریکی با استفاده از تکنیک آنتی سنس الیگو داکسی نوکلئوتید در مقایسه با آنتی بادی بلوکان

سلولهای دندریتیکی از سلولهای مهم عرضه کننده آنتی ژن می باشند که یکی از اجزاء اصلی سیستم ایمنی را تشکیل می دهند. این سلولها در شروع و تنظیم پاسخهای ایمنی وابسته به سلولهای t نقش مهمی را ایفاء می کنند.همچنین سلولهای دندریتیکی از سلولهای ایده آل در زمینه ایمونوتراپی می باشند که در درمان بیماریهای خود ایمنی و رد پیوند کاربرد دارند. انتقال آنتی سنس به داخل سلولهای دندریتیکی تکنیکی جدید در درمان بسیاری از بیماریها می باشد. آنتی سنس باعث ممانعت از بیان ژن در سطح نسخه برداری می شود. خاموش کردن بیان ژن بطور انتخابی روشی موثر برای تغییر در عملکرد سلولها است. در این تحقیق به منظور ایجاد سلولهای دندریتیک تولروژن نقش مولکول cd40 مورد بررسی قرار گرفت و سپس خصوصیات سلولهای تولروژنیک در محیط آزمایشگاه مورد بررسی قرار گرفت. ابتدا سلولهای دندریتیکی از طحال موشهای balb/c استخراج و پس از تعیین میزان خلوص با استفاده از فلو سیتومتری زمان مناسب ترانسفکشن و غلظت مناسب ماده ترانسفکت و آنتی سنس با استفاده از ماده ترانسفکت لیپوفکت آمین 2000 مشخص شد که غلظت 2 میکرو لیتر ماده ترانسفکت و غلظت 6 میکرو مول آنتی سنس غلظتهای مناسب در نظر گرفته شدند. جهت طراحی آنتی سنس از نرم افزار oligo analyzer استفاده گردید. سپس اثرات سیتو توکسیک لیپوفکت آمین 2000 و آنتی سنس بر روی سلولهای دندریتیکی با استفاده از کیت annexin v, pi به روش فلوسیتومتری و رنگ حیاتی تریپان بلوتعیین گردید و در مرحله بعد میزان کاهش بیان cd40 در سطح ژن با استفاده از روش rt-pcr کمی پس از گذشت 36 ساعت و در سطح بیان پروتئین با استفاده از فلوسیتومتری دو رنگی (cd11c, cd40) بعد از گذشت 48 ساعت مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین از رده سلولی bcl1 بدلیل اینکه بصورت دائمی مولکول cd40 را بیان می کنند به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. توانائی سلولهای دندریتیکی تولروژن در تحریک لنفوسیتهای t آلوراکتیو با استفاده از تست مختلط لنفوسیتی مورد بررسی قرار گرفت. برای این کار سلولهای دندریتیک اشعه دیده با سلولهای t آلوژن از موشهای c57bl/6 خالص شده به مدت 54 ساعت کشت داده شدند و تکثیر سلولی با استفاده از میزان جذب تیمیدین نشاندار بر اساس شمارش در دقیقه سنجیده شد. همچنین مایع روئی کشت سلولها جمع آوری گردید و پروفایل سیتوکاینی )γ (il-4, ifn- بعد از گذشت 48 ساعت از کشت با روش الیزا تعیین گردید.پروفایل سیتوکاینی آن نیز با استفاده از روش الیزای نقطه ای مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور در ابتدا زمان مناسب جهت بررسی پروفایل و نسبت سلولهای dc/t تعیین گردیدوسپس تست انجام پذیرفت. بدلیل نقش cd40 در تحریک تولید اینترلوکین 12 آنتی بادی تحریکی بر علیه cd40 به سلولهای دندریتیکی ترانسفکت شده با آنتی سنس اضافه و پس از گذشت 48 ساعت مایع روئی سلولهای کشت داده شده جمع آوری و میزان اینترلوکین12 با استفاده از تست الیزا سنجیده شد. نتایج بدست آمده نشان می دهد که آنتی سنس شماره 1 و2 در سلولهای دندریتیکی بترتیب باعث 22و 24 درصد و در رده سلولی bcl1 20و 18 درصد کاهش بیان cd40 گردیده است. ماده ترانسفکت و آنتی سنس تاثیری بر روی حیات سلولها ندارند.ممانعت از بیان cd40 باعث افزایش تولید اینترلوکین4 ٬ کاهش تولید اینترلوکین12 و اینترفرون گاما و شیفت پاسخ بسمت th2 گردیده است. بعلاوه سلولهای دندریتیکی که بیان cd40 بر سطح آنها کاهش یافته است پاسخ الواستیمولاتوری ضعیفی از خود نشان میدهند انتی سنس شماره 1و 2 ٬ 20و 22 درصد و انتی بادی بلوکان 23 درصد با عث کاهش درایندکس تحریک گردیده اند.