امروزه استفاده از سلول های بنیادی و به ویژه سلول های بنیادی مزانشیمی بدلیل توانایی تکثیر بالا و پتانسیل تمایز به سلول های مختلف از جمله کندروسیت ها مورد توجه محققین مهندسی بافت غضروف قرار گرفته است. یکی از عوامل موثر در رشد و تمایز سلول های بنیادی به سلول های کندروسیت، موضوع انتخاب بستر و داربست مناسب در محیط کشت سلول بوده و می باشد. تاکنون از میان داربست های گوناگون، داربست های هیدروژلی با منبع طبیعی و یا سنتزی به عنوان داربست های ویژه در مهندسی بافت غضروف مورد مطالعه قرار گرفته اند. لذا هدف از انجام این پایان نامه مطالعه بازدهی و اثر بسترهای آلژینات و poly(hema) در تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی بدست آمده از بافت چربی انسانی به سلول های کندروسیت بر اساس سنجش بیان مارکرهای ویژه غضروفی نظیر کلاژن نوع دو و گلیکوزآمینوگلیکان های سولفاته می باشد. بدین منظور، ابتدا سلول های بنیادی مزانشیمی از بافت چربی انسانی جداسازی و پس از کشت و تکثیر، به مدت 14 روز در شرایط مختلف کشت شامل: بستر poly(hema)، مهره های آلژینات و کنترل در حضور محیط تمایزی کشت داده شده و در پایان برای انجام تست های rt-pcr،western blotting و رنگ آمیزی هیستوشیمی alcian blue جمع آوری شدند. نتایج حاصل نشان می دهد که در هر سه شرایط مختلف کشت، تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی به سلول های کندروسیت با تأیید بیان مارکرهای ویژه غضروفی رخ داده است. نتایج حاصل هم چنین نشان می دهند که بیشترین میزان تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی به سلول های کندروسیت، مربوط به استفاده از مهره های آلژینات به عنوان بستر سه بعدی می باشد.

اسید فسفاتازها هیدرولیز پیوند فسفو استری انواع مختلفی از گهرمایه ها در ph اسیدی را کارگشایی می کنند. این آنزیم ها نقش اصلی را در تامین فسفات مورد نیاز سلول دارند و این نقش را از طریق جذب (absorption)، گردش (recycling) و جمع آوری (scavenging) این عنصر از منابع فسفات بیرون و درون سلول ایفا می کنند که در گیاهان به عنوان موجوداتی ثابت اهمیت خاصی دارد. بررسی آماری و معنی دار شدن تفاوت های میانگین های شاخص های مورفولوژیک مانند وزن تر و خشک ریشه و اندام هوایی، طول ریشه اصلی، طول و تعداد ریشه های جانبی و تعداد ریشه های مویی در آرابیدوپسیس تالیانا حاکی از آن است که از نظر فسفات در دسترس و نحوه پاسخ گیاه به آن چهار حالت قابل تعریف است: فقدان فسفات، کمبود فسفات، فسفات کافی و فسفات اضافی. اندازه گیری میزان pi محلول، p کل و فعالیت فسفاتازی در ریشه و ساقه گیاهان تحت تیمار نشان داد که کاهش فسفات محیط منجر به کاهش pi محلول و p کل گیاه شده و فعالیت فسفاتازی کل همواره بالاتر بوده است. در بررسی های زمانی مشخص شد در فقدان فسفات افزایش فعالیت فسفاتازی در تیمار 3 روز و 21 روز در بیشترین مقدار خود است. همچنین بررسی تاثیر غلظت های متفاوت فسفات در محیط کشت نشان داد میزان فسفات آزاد سلولی دامنه تغییرات محدودی دارد و فسفات اضافی بیشتر در اندام هوایی ذخیره می شود و برای تنظیم هموستازی فسفات آزاد در مواقع ضروری به کار گرفته می شود. گیاه آرابیدوپسیس دارای 58 ژن رمزکننده اسید فسفاتاز است که به 5 گروه اسید فسفاتازهای بنفش (29 ژن)، اسید فسفاتازهای گروه had (12 ژن)، فسفو لیپید فسفاتازها (12 ژن)، هیستیدین فسفاتازها (3 ژن) و اسید فسفاتازهای sure (2 ژن) تعلق دارند. بیشتر اسید فسفاتازهای گیاه دارای محصول پیرایشی متعددی نیز می باشند. بررسی جمعی بیان اسید فسفاتازهای گیاه آرابیدوپسیس در تیمار غلظت های مختلف فسفات در ریشه و ساقه نشان داد که در حضور غلظت های مختلف فسفات برخی از ژن ها در ریشه و اندام هوایی رفتارهای بیانی مشابهی دارند و در خوشه های بیانی مشابهی قرار می گیرند. به طوری که از نظر الگوی بیان، این ژن ها در ریشه به پنج گروه و در اندام هوایی به دو گروه قابل تقسیم هستند. بررسی بیان اسید فسفاتازها در طول زمان کشت در شرایط بدون فسفات و با 5 میلی مولار فسفات نشان داد که طول زمان تنش نیز در نحوه پاسخ اسید فسفاتازها تاثیر دارد. بر اساس الگوی زمانی بیانی نیز ژن های اسید فسفاتاز در ریشه و اندام هوایی به چندین گروه قابل تقسیم هستند. این بررسی نیز نشان داد که تنها معدودی از ژن ها رفتارهای بیانی مشابهی در ریشه و اندام هوایی دارند و یا در خوشه های بیانی مشابهی قرار می گیرند. با استفاده از دودمان های خالص جهش یافته ژن های pap7، pap9، pap17، pap18، pap21 و pap26 مشخص شد که در بیشتر موارد بین اسید فسفاتازها رابطه جبرانی بین اعضای هم خوشه وجود دارد، گرچه در این رابطه جبرانی هم خوشه بودن شرط لازم نیست. همچنین استفاده از دودمان های تراریخت با بیان فراوان ژن های pap7، pap17، pap18 و pap26 نیز این موضوع را تایید کرد. بررسی توالی های پیش بر ژن های اسید فسفاتاز نشان داد که بین نوع و فراوانی موتیف های پاسخ دهنده به فسفات و نحوه بیان ژن ها در شرایط مورد آزمایش تا حدی همبستگی وجود دارد. زیرا خوشه بندی ژن های اسید فسفاتاز بر اساس الگوی بیان در غلظت های متفاوت فسفات و نیز خوشه بندی بر اساس نوع و تعداد موتیف های پاسخ دهنده به فسفات با یکدیگر قابل مقایسه بوده و تا 70 درصد شباهت بین آن ها وجود دارد. بررسی بیان ژن ها در تنش های شوری، سرما، گرما، تیمار با قارچ و نیز استفاده از کیتین بعنوان الیسیتور نشان داد که الگوی بیان ژن های اسید فسفاتاز در اثر عوامل فوق به طور متمایزی تغییر می کند. گرچه در بیشتر موارد بین تعداد نگاره و نحوه بیان ژن ارتباطی وجود ندارد، ولی در مورد حضور موتیف های شناخته شده برای تنش های زیستی و نحوه پاسخ ژن ها به عوامل بیماریزا می توان چنین ارتباطی را استنباط کرد. همچنین خوشه بندی سلسله مراتبی پیش بر ژن های اسید فسفاتاز با استفاده از موتیف های شناخته شده برای پاسخ به تنش های غیر زیستی نشان داد که بین خوشه بندی ژن ها بر اساس داده های بیان و نیز خوشه بندی بر اساس حضور و تکرار و نوع موتیف های پاسخ دهنده به شرایط محیطی کمتر از 50 درصد شباهت وجود دارد.

خانواده ادامتیس در تجزیه و بازسازی ماتریکس خارج سلولی و دیگر فرایندهای زیستی نقش دارند. اسیب اکسیداتیو در سلول های اپیتلیوم رنگدانه ای شبکیه چشم به دلیل عدم تعادل بین تولید و حذف گونه های واکنشگر اکسیژن می باشد که باعث نقص در عملکرد این سلول ها می شود و این، عامل اصلی اسیب ماتریکس خارج سلولی در بیماری دژنره شدن ماکولا وابسته به سن می باشد. هدف از این تحقیق بررسی تاثیر استرس اکسیداتیو روی بیان ژن¬های ادامتیس 3 ،2 ،1 و شبه ادامتیس 2 در سلولهای اپیتلیوم رنگدانه ای شبکیه چشم بود. برای ایجاد استرس اکسیداتیو، سلول های اپیتلیوم رنگدانه¬ای شبکیه در ابتدا کشت داده شده و سپس در معرض دوز های350 ،250 ،100 ماکرومولار هیدروژن پراکسید قرار گرفتند. تغییر در بیان ژن ها توسط real time pcr ارزیابی شد. هیدروژن پراکسید میزان بقاء سلولی را در مقایسه با گروه کنترل کاهش داد. استرس اکسیداتیو روی بیان ژن ها تاثیر گذاشت و بیان ژنهای¬ ادامتیس 3 ،1 و شبه ادامتیس 2 کاهش پیدا کرد. استرس اکسیداتیو روی بیان ژن های ادامتیس3 ،1 و شبه ادامتیس 2 در سلول های اپیتلیال رنگدانه¬ای شبکیه چشم تاثیر دارد. نتایج نشان می دهد که این ژن¬ها در بیماری دژنره شدن ماکولا وابسته به سن نقش بالقوه¬ای دارند

سلولهای دندریتیکی از سلولهای مهم عرضه کننده آنتی ژن می باشند که یکی از اجزاء اصلی سیستم ایمنی را تشکیل می دهند. این سلولها در شروع و تنظیم پاسخهای ایمنی وابسته به سلولهای t نقش مهمی را ایفاء می کنند.همچنین سلولهای دندریتیکی از سلولهای ایده آل در زمینه ایمونوتراپی می باشند که در درمان بیماریهای خود ایمنی و رد پیوند کاربرد دارند. انتقال آنتی سنس به داخل سلولهای دندریتیکی تکنیکی جدید در درمان بسیاری از بیماریها می باشد. آنتی سنس باعث ممانعت از بیان ژن در سطح نسخه برداری می شود. خاموش کردن بیان ژن بطور انتخابی روشی موثر برای تغییر در عملکرد سلولها است. در این تحقیق به منظور ایجاد سلولهای دندریتیک تولروژن نقش مولکول cd40 مورد بررسی قرار گرفت و سپس خصوصیات سلولهای تولروژنیک در محیط آزمایشگاه مورد بررسی قرار گرفت. ابتدا سلولهای دندریتیکی از طحال موشهای balb/c استخراج و پس از تعیین میزان خلوص با استفاده از فلو سیتومتری زمان مناسب ترانسفکشن و غلظت مناسب ماده ترانسفکت و آنتی سنس با استفاده از ماده ترانسفکت لیپوفکت آمین 2000 مشخص شد که غلظت 2 میکرو لیتر ماده ترانسفکت و غلظت 6 میکرو مول آنتی سنس غلظتهای مناسب در نظر گرفته شدند. جهت طراحی آنتی سنس از نرم افزار oligo analyzer استفاده گردید. سپس اثرات سیتو توکسیک لیپوفکت آمین 2000 و آنتی سنس بر روی سلولهای دندریتیکی با استفاده از کیت annexin v, pi به روش فلوسیتومتری و رنگ حیاتی تریپان بلوتعیین گردید و در مرحله بعد میزان کاهش بیان cd40 در سطح ژن با استفاده از روش rt-pcr کمی پس از گذشت 36 ساعت و در سطح بیان پروتئین با استفاده از فلوسیتومتری دو رنگی (cd11c, cd40) بعد از گذشت 48 ساعت مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین از رده سلولی bcl1 بدلیل اینکه بصورت دائمی مولکول cd40 را بیان می کنند به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. توانائی سلولهای دندریتیکی تولروژن در تحریک لنفوسیتهای t آلوراکتیو با استفاده از تست مختلط لنفوسیتی مورد بررسی قرار گرفت. برای این کار سلولهای دندریتیک اشعه دیده با سلولهای t آلوژن از موشهای c57bl/6 خالص شده به مدت 54 ساعت کشت داده شدند و تکثیر سلولی با استفاده از میزان جذب تیمیدین نشاندار بر اساس شمارش در دقیقه سنجیده شد. همچنین مایع روئی کشت سلولها جمع آوری گردید و پروفایل سیتوکاینی )γ (il-4, ifn- بعد از گذشت 48 ساعت از کشت با روش الیزا تعیین گردید.پروفایل سیتوکاینی آن نیز با استفاده از روش الیزای نقطه ای مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور در ابتدا زمان مناسب جهت بررسی پروفایل و نسبت سلولهای dc/t تعیین گردیدوسپس تست انجام پذیرفت. بدلیل نقش cd40 در تحریک تولید اینترلوکین 12 آنتی بادی تحریکی بر علیه cd40 به سلولهای دندریتیکی ترانسفکت شده با آنتی سنس اضافه و پس از گذشت 48 ساعت مایع روئی سلولهای کشت داده شده جمع آوری و میزان اینترلوکین12 با استفاده از تست الیزا سنجیده شد. نتایج بدست آمده نشان می دهد که آنتی سنس شماره 1 و2 در سلولهای دندریتیکی بترتیب باعث 22و 24 درصد و در رده سلولی bcl1 20و 18 درصد کاهش بیان cd40 گردیده است. ماده ترانسفکت و آنتی سنس تاثیری بر روی حیات سلولها ندارند.ممانعت از بیان cd40 باعث افزایش تولید اینترلوکین4 ٬ کاهش تولید اینترلوکین12 و اینترفرون گاما و شیفت پاسخ بسمت th2 گردیده است. بعلاوه سلولهای دندریتیکی که بیان cd40 بر سطح آنها کاهش یافته است پاسخ الواستیمولاتوری ضعیفی از خود نشان میدهند انتی سنس شماره 1و 2 ٬ 20و 22 درصد و انتی بادی بلوکان 23 درصد با عث کاهش درایندکس تحریک گردیده اند.

خونسازی سرطانی یک کلون از سلولهای بدخیم را ایجاد می کند . این کلون می تواند خونسازی طبیعی را در ‏‎in vivo‎‏ کاهش دهد. کشت همزمان سلولهای مغز استخوان و سلولهای سرطانی می تواند مدلی برای ارزیابی تاثیرات سلولهای سرطانی بر خونسازی باشد.

هدف از انجام این مطالعه بررسی چگونگی اثر ‏‎tgf-b2‎‏ بر بیان ژن ‏‎gm-csf‎‏ انسانی می باشد. ‏‎(gm-csf) granulocyte- macrophage colony stimulating factor ‎‏ قادر به تحریک پدیده تمایز در سلولهای مادری خونساز بوده و فعالیت سلولهای بالغ خونی را تحت تاثیر قرار می دهد. از این جهت همیشه بعنوان یک عامل مهم در پدیده خونسازی مورد توجه بوده است. سلولهای 5637 بدلیل افزایش نیمه عمر رونوشتهای ‏‎(mrna)‎‏ و بیان فراوان ژن ‏‎gm-csf‎‏ مدلی مناسب برای بررسی بیان ژن مورد نظر هستند. ‏‎(tgf-b) transforming growth factor-b‎‏ از نخستین عوامل تنظیم کننده پدیده خونسازی بود که مورد شناسایی قرار گرفت. در این مطالعه از ‏‎tgf-b2‎‏ جهت بررسی بیان ژن ‏‎gm-csf‎‏ استفاده شده است. در آزمایشات انجام شده سلولهای 5637 در معرض غلظتهای ‏‎tgf-b2 (0-5) ng/ml‎‏ قرار گرفتند سپس بوسیله ‏‎elisa‎‏ مقدار ‏‎gm-csf‎‏ موجود در محیط رویی کشتهای سلولی مورد سنجش قرار گرفت. آزمایشات نشان دادند که مقدار ‏‎gm-csf‎‏ موجود در محیط کشت پس از 48 ساعت افزایش می یابد این افزایش در غلظت ‏‎5ng/ml‎‏ به بیشترین و معنی دارترین مقدار خود می رسد. در عین حال نتایج نشان دادند که ‏‎tgf-b2‎‏ بر شماره سلولها هیچ تاثیری نداشته و شمارش سلولهای شاهد و آزمون تفاوت با ارزشی ندارد. آزمایش سنجش فعالیت بیولوژیک ‏‎gm-csf‎‏ از محلول رویی کشتهای شاهدو آزمون (به روش تعیین شماره کلنیهای ‏‎cfu-gm‎‏) نشان دادند که احتمالا در پاسخ به ‏‎tgf-b2‎‏ یک نوع عامل مهارکننده فعالیت کلنی زایی نیز تولید می شود که می تواند تا حدودی موجب مهار فعالیت ‏‎gm-csf‎‏ گردد. آزمایشات ‏‎northern blot, slot blot‎‏ از محتوای ‏‎rna‎‏ سلولهای شاهد و آزمون نشان دادند. اگرچه مقدار ‏‎mrnay-actin‎‏ ثابت مانده است مقدار ‏‎mrna‎‏ ‏‎gm-csf‎‏ در سلولهای آزمون افزایش قابل توجهی یافته اند. این آزمایشات ‏‎tgf-b2‎‏ را بعنوان تنظیم کننده مثبت بیان ژن‏‎gm-csf‎‏ در دودمان سلولی 5637 معرفی کرده و تنظیم در سطح رونویسی را مسئول تغییر در بیان ژن ‏‎gm-csf‎‏ در سلولهای 5637 نشان می دهند.