بررسی خاموشی ژن (های) مرتبط با کمپلکس سیناپتونی ذرت با استفاده از ناقل های rnai در توتون

نوترکیبی ژنتیکی یکی از مراحل مهم در پروسه زندگی سلول ها می باشد. مطالعه بر روی نوترکیبی همولوگ ها می-تواند برای هدف گیری ژن ها و تولید واریته های آپومیکت در گیاهانی مثل ذرت و برنج مورد استفاده قرار گیرد. مهمترین عامل در وقوع این رخداد،عدم وقوع میوز به هنگام تشکیل کیسه های جنینی می باشد. تاکنون تعدادی از ژن های درگیر در نوترکیبی گزارش شده است. تفکیک صحیح کروموزوم ها در طی پروسه میوز بستگی به جفت شدن صحیح کروموزموم ها و تشکیل بی والنت ها در زیگوتن میوز دارد. dmc1 یکی از آنزیم های نوترکیبی و از اعضای خانواده reca/rad51 بوده و نقش مهمی در نوترکیبی میوزی بازی می کند و از ویروس تا انسان محافظت شده می باشد. خاموشی ژن dmc1 می تواند باعث اختلال در تشکیل کمپلکس سیناپتونی و نقص در تشکیل بی-والنت ها و متعاقب آن تفکیک نامتعادل و نامنظم کروموزوم ها در هنگام تشکیل گامت ها شود. بر همین اساس استفاده از فن آوری rnai در بررسی خاموشی این ژن از طریق تولید گیاهان تراریخته هدف گیری شد. به دلیل اطلاعات اندک از ژن های میوزی در ذرت ، در ابتدا طول کامل cdna dmc1 ذرت را از طریق insilico cloning و مقایسه ژن dmc1 برنج با est های ذرت پیدا شد، سپس توالی اسید آمینه آن برای مقایسات فیلوژنتیکی در بین پروکاریوتها ، آرکئوباکتریها و یوکاریوتها به کار رفت. برای تبیین بیشتر نقش dmc1 ساختار و عملکرد محصول این ژن از طریق مطالعات تطبیقی و مقایسه ای آشکار گردید. پس از استنتاج های کلی در خصوص نقش dmc1 قطعه تکثیری از انتهای ´3 اگزون 15 ذرت به طول تقریبی bp400 در ناقل phanibal به سه صورت سنس و آنتی سنس جداگانه و هر دو با هم به عنوان کاست های rnai قرار گرفت. سپس کاست ها بوسیله آنزیم noti از phanibal جدا شده و ناقل های باینری به نامهای part-dmc1-asa, part-dmc1-as , part-dmc1-s جهت انتقال به گیاه توتون ساخته شدند. برگ های توتون بوسیله این سه کاست که حاوی ژن nptii)) مقاومت به کانامایسین بوده، بمباران شده و به طور تدریجی به محیط های حاوی 25 و50 میلی گرم در لیتر کانامایسین جهت گزینش تراریخته از غیر تراریخته، کشت شدند. پس از باززایی، dna گیاهان تراریخته فرضی و شاهد استخراج و با آغازگرهای اختصاصی dmc1 و nptii عملیات pcr انجام گرفت. متاسفانه، علیرغم تکرار آزمایشات هیچ تکثیری با پرایمرهای اختصاصی برای ژن dmc1 در گیاه توتون غیر تراریخته به دست نیامد. بعلاوه، تفاوت معنی داری بین گلدهی و میزان بذور تولیدی گیاهان تراریخته و غیر تراریخته توتون مشاهده نگردید. این موضوع به احتمال زیاد می تواند به خاطر تفاوت در عدم تشابه کامل اگزون 15 ذرت و ناحیه ´3 این ژن در توتون بوده و به همین دلیل وکتور rnai تولید شده در توتون کارآمد نبوده است. بنابراین، تصمیم گرفته شد که حداقل سه کاست ساخته شده به کالوس حاصل از جنین های نارس ذرت (هیبرید سینگل کراس 704) شلیک شده، و فعالیت ژن dmc1 در سطح کالوس مورد مطالعه قرار بگیرد. بدین منظور و بر اساس پتانسیل القایی سیستم rnai در سلولها، پس از سه و هفت روز، rna کل از بافت های مختلف ذرت به عنوان شاهد و کالوس های شلیک شده استخراج گردید. جهت انجام pcr rt- اولین رشته cdna ساخته شد و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن dmc1 به مطالعه نیمه کمی بیان dmc1 مبادرت گردید. آغازگرهای اختصاصی ژن اکتین به عنوان ژن کنترل کننده داخلی طراحی و برای نرمال کردن داده های rt به کار رفت. آنالیز ژن dmc1 ذرت در هر دو نوع بافت رویشی و زایشی از خود بیان نشان داد. rt-pcr نیمه کمی و real time pcr نشان داد که تفاوت معنی داری بین بیان نسبی ژن dmc1 در کالوس های شلیک شده با کاست rnai و شاهد وجود دارد. این امر نشان داد که خاموشی با کاست ساخته شده rnai موفق بوده است.