مطالعه کمّی قارچ های مولّد آفلاتوکسین و اکراتوکسین مبتنی بر روش های pcr و بررسی همبستگی آن با میزان توکسین ها در ارقام کشمش خراسان رضوی

کشمش میوه خشک شده انگور است که به صورت خام یا به عنوان یکی از اجزای تشکیل دهنده مواد غذایی در محصولاتی نظیر فراورده های نانوایی و نوشیدنی ها استفاده می شود. ایران یکی از صادرکنندگان اصلی کشمش در سال های اخیر محسوب می گردد، ازاین رو اطمینان از کیفیت میکروبی و ایمنی این محصول از اهمیت زیادی برخوردار است. یکی از مهم ترین نگرانی ها در زمینه ایمنی این محصول، حضور قارچ های تولید کننده توکسین می باشد. به منظور جداسازی و شمارش فلور قارچی ارقام عمده کشمش (پلویی، پیکامی و تیفی) در خراسان رضوی از چهار محیط کشت ygc، pda، cz و dg18 استفاده گردید. نتایج آماری نشان داد که آلودگی قارچی نمونه های کشمش تیفی بیش-تر از دیگر نمونه ها بود. همچنین روش خشک کردن تأثیر معنی داری در میزان آلودگی قارچی نداشت. پس از خالص?سازی ایزوله ?های جدا شده، شناسایی اولیه جدایه?های حاصل به روش ماکروسکوپی و میکروسکوپی انجام پذیرفت. بر اساس نتایج به دست آمده جنس? های aspergillus و penicillium به ترتیب فراوان?ترین قارچ?های جدا شده از نمونه?های کشمش بودند. به منظور شناسایی جدایه ها در حد گونه، قطعه bp 600 از ناحیهinternal transcribed spacer 5.8srrna کپک ها به روش واکنش زنجیره ای پلی مراز تکثیر شد. براساس نتایج به دست آمده، نمونه های کشمش حاوی گونه های مختلفی از جنس های aspergillus، penicillium، rhizomucor، mucor، alternaria و cladosporium بودند که در این میان aspergillus niger بیشترین درصد فراوانی را به خود اختصاص داد. ارزیابی ایزوله های قارچی جدا شده از نمونه های کشمش با استفاده از روش مولکولی pcr به منظور شناسایی قارچ های مولّد اکراتوکسین و آفلاتوکسین نشان داد که از بین 50 ایزوله قارچی جدا شده از نمونه های کشمش در محیط کشت pda، 6 جدایه تولید کننده اکراتوکسین و 2 جدایه تولید کننده آفلاتوکسین بودند. همچنین 45 نمونه کشمش (پلویی، پیکامی و تیفی) به لحاظ حضور dna قارچ های تولید کننده اکراتوکسین و آفلاتوکسین و نیز بیان این ژن ها (به روش های pcr و reverse transcription-pcr) مورد بررسی قرار گرفتند. بر اساس نتایج به دست آمده تنها نمونه های کشمش تیفی (15 نمونه) آلوده به dna قارچ های مولّد سم اکراتوکسین بودند. این در حالی است که در هیچ یک از نمونه های کشمش، dna قارچ مولّد آفلاتوکسین مشاهده نشد. بررسی بیان ژن مولّد اکراتوکسین با استفاده از روش reverse transcription-pcr در نمونه های کشمش تیفی نشان داد که از مجموع 15 نمونه کشمش تیفی، در 11 نمونه ژن دخیل در مسیر بیوسنتز اکراتوکسین در سطح mrna بیان شد. همچنین مطالعه کمّی بیان ژن های مسیر بیوسنتز اکراتوکسین و آفلاتوکسین قارچی بر پایه روش مولکولی real-time pcr مطلق و اندازه گیری میزان سموم اکراتوکسین و آفلاتوکسین به روش hplc، نشان داد که همبستگی مثبتی بین تعداد کپی cdna حاصل از نسخه برداری از ژن های مسیر بیوسنتز اکراتوکسین (782/0=r2) و آفلاتوکسین (870/0=r2) با غلظت توکسین تولید شده وجود داشت.