طراحی، ساخت و کلون سازی ژن کد کننده پروتئین ترکیبی مهارکننده بافتی ماتریکس متالوپروتئیناز4-پپتید شبه کلروتوکسین عقرب مزوبوتوس اوپئوس ایرانی (timp4-meict)

امروزه علم مهندسی پروتئین, دریچه ای نوین برای تولید محصولات زیستی جدید به روی محققان گشوده است. طراحی و ساخت پروتئین های جدید با عملکرد های مورد نظر و همچنین, دستکاری در سایز و ساختار سه بعدی ملکول های پروتئینی با تکنولوژی مهندسی پروتئین امکان پذیر است [1]. از جمله تکنیک های ارزشمند در مهندسی پروتئین, اتصال ژن های مختلف به منظور تولید و بیان ملکول های مرکب حاوی پروتئین های متفاوت است [2]. ساخت بسیاری از پروتئین های هدف یا پلی پپتید های خاص از طریق تکنیک های اتصال ژن که منجر به بیان پروتئین های ترکیبی می شود روندی رو به رشد است. معمولا" پروتئین های ترکیبی خصوصیات عملکردی هر یک از پروتئین های اصلی را دارا هستند [3]. ما در این مطالعه با استفاده از تکنیک های مهندسی ژنتیک بخش های عملکردی دو ژن مهارکننده بافتی ماتریکس متالوپروتئیناز-4 (timp-4) و ژن کد کننده پپتید شبه کلروتوکسین عقرب مزوبوتوس اوپئوس ایرانی (meict) را جهت ساخت یک پروتئین ترکیبی با اهداف درمانی و خواص ضد متاستازی در ساختاری واحد قرار داد ایم. مهار کنندگان بافتی متالوپروتئیناز ها (timps) مهارکنندگان اختصاصی ماتریکس متالوپروتئیناز ها (mmps) بوده, و فعالیت آن ها را در بافت ها کنترل می کنند . ماتریکس خارج سلولی (ecm) بخش پیچیده, پویا و بسیار ضروری همه بافت ها بوده که مهاجرت سلول ها در طی دوره تکوین و مورفوژنز, بهبود زخم ها و بازآرایی بافتی نیازمند تخریب کنترل شده این ماتریکس است [4]. ماتریکس متالوپروتئیناز ها دارای 23 عضو وابسته به روی بوده و اندوپپتیداز ها یی هستند که قادرند تقریبا" تمام اجزای ماتریکس خارج سلولی را تخریب کنند [5]. تحت شرایط فیزیولوژیکی نرمال فعال شدن mmp ها در سطوح مختلف به صورت دقیقی تنظیم می شود [6] و از دست رفتن این کنترل باعث ایجاد بیماری هایی مثل سرطان, بیماری ها ی قلبی-عروقی و ورم مفاصل می شود[7]. خانواده timp در پستانداران 4 عضو (timp1-4) دارد که timp-4 جدید ترین عضو این خانواده است. timp ها دارای یک پایانه انتهایی آمینو 125 اسید آمینه ای و یک پایانه انتهایی کربوکسیلی 65 اسید آمینه ای بوده و هر یک از این قلمرو ها حاوی 3 باند دی سولفیدی حفاظت شده است. پایانه انتهایی آمینو timp-4 تا خورده و به عنوان یک واحد مجزا برای مهار mmpها عمل می کند [8]. در واقع timp از طریق گروه آمینوی اسید آمینه سیستئین در پایانه آمینوی خود, اتم روی (zn)در جایگاه فعال mmp ها را شلاته کرده و از این طریق سبب مهار mmp ها می شود [9]. فعالیت mmp ها برای تهاجم سلول های توموری, شکل گیری متاستاز و رگ زایی نیاز است و بنابراین, مهار آن ها توسط مهارکنندگان طبیعی مثل timp-4 و یا ساخت مهار کنندگان مصنوعی راهی برای مقابله با تهاجم ومتاستاز تومور ها خواهد بود [10]. ژن دیگر مورد نظر در این مطالعه, ژن کد کننده پپتید شبه کلروتوکسین از عقرب مزوبوتوس اوپئوس ایرانی (meict) است. کلروتوکسین اولین بار از سم عقرب لیوروس کوینکواستریاتوس استخراج شد و یک پپتید کوتاه زنجیره 36 اسید آمینه ای است [11]. این پپتید سبب مهار گروهی از کانال های کلر شده و تغییرات گوناکونی را در فیزیولوژی سلول سبب می شود, و شامل 4 پل دی سولفیدی بوده که توسط 8 بنیان سیستئین تشکیل می شود, و از 3 صفحه بتا ویک مارپیچ آلفا تشکیل شده است. کلروتوکسین اولین لیگاند گزارش شده با تمایل بالا به کانال های کلر است که قادر است دریچه های کوچک کلر را ببندد [12]. تحقیقات روی سلول های سرطانی نشان داده که کانال های یونی خاصی در رشد کنترل نشده و تهاجم توموری نقش داشته و مهار کنندگان این کانال ها قادرند رشد تومور را مهار کنند. نقش کانال های کلر و پتاسیم در مورد تومور های مغزی اولیه که سبب تهاجم و متاستاز می شوند ثابت شده است. برای عملکرد تهاجمی سلول های توموری کاهش حجم سلول نیاز است و این امر با خارج شدن آب توسط نیروی شیب الکتروشیمیایی حاصل از کانال های کلر و پتاسیم میسر می شود. کاهش حجم سلول سبب تسهیل تهاجم و متاستاز سلول های سرطانی می شود. بنابراین, مهار کانال های کلر سبب تاخیر در تغییر اندازه سلول شده و تهاجم سلول های توموری را تعدیل می کند. مطالعات اخیر نیز نشان دادند که ماتریکس متالوپروتئیناز-2 (mmp-2) یک رسپتور اختصاصی دیگر برای کلروتوکسین محسوب می شود. mmp-2 پروتئینازی است که در تهاجم توموری درگیر بوده و خصوصا" در گلیوما و سرطان های مربوطه افزایش بیان داشته اما در سلول های نرمال مغز بیان نمی گردد. اتصال کلروتوکسین به mmp-2 مانع از کاهش حجم ابعاد سلول گلیوما شده و قابلیت مهاجرت آن را کاهش می دهد [13]. در این مطالعه ژن کد کننده این پپتید از یک گونه عقرب ایرانی به نام مزوبوتوس اوپئوس انتخاب شده است. بررسی های اولیه توسط دکتر آیت و همکاران در سال 2011 نشان داد که طول cdna کد کننده ی این توکسین، 102 نوکلئوتید بوده و دارای 81% تشابه نوکلئوتیدی با توالی کد کننده ی پپتید ctx می باشد [14]. امید است این پژوهش، گام نخستین برای بررسی های بالینی بعدی و بررسی عملکرد این پروتئین ترکیبی در مهار متاستاز انواع سلول های سرطانی باشد.