کلونینگ ژن های fry1 و old101 با استفاده از سیستم بیانی pet

ژن fry1 در گیاه آرابیدوپسیس یک ژن واکنشگر به تنش های غیر زیستی است که آنزیمی با دو کارکرد 3 (2) 5- بیس فسفات نوکلئوتیدازی و اینوزیتول پلی فسفات 1-فسفاتازی را کد می کند. فعالیت اینوزیتول پلی فسفات 1-فسفاتازی پروتئین fry1 نشان می دهد که این پروتئین به عنوان عامل کاتابولیسم اینوزیتول 1، 4، 5، تری فسفات (ip3) در مسیر پیام رسانی فسفواینوزیتید نقش دارد. نقش دیگر fry1، تجزیه ی فسفوآدنوزین 3، 5- بیس فسفات ((pap است که در سرکوب خاموشی پس از رونویسی ژن دخالت دارد. جهش نقطه ایold101 در اگزون شماره ? ژن fry1 باعث جایگزینی نوکلئوتید g با نوکلئوتید aشده است. این جهش در پروتئین کد شده توسط ژنfry1 سبب جایگزینی اسیدآمینه آسپارتیک اسید (asp38) با اسیدآمینه آسپاراژین(asn38) شده است [shirzadian-khoramabad et al., 2008]. به منظور بررسی نقش جهش old101 در ساختار این پروتئین، مدل سازی مولکولی پروتئین های fry1 و old101 بر اساس همولوگ مخمری این پروتئین (hal2) انجام شد. آنالیز مدل مولکولی old101 نشان داد که جهش old101 در ناحیه ای سنجاق سری موسوم به flap شامل رزیدوهای 31 تا 42 (در hal2 رزیدوهای 34 تا 45) اتفاق افتاده است که مثل یک درپوش روی جایگاه فعال را می پوشاند. با مطالعه ی پیوندهای هیدروژنی، پل های نمکی و سطح در دسترس این ناحیه، این فرضیه مطرح شد که این تغییر ساختار در ناحیه ی سنجاق سری پروتئین old101، در دسترسی سوبستراهای این آنزیم به جایگاه فعال نقش داشته باشد و منجر به کاهش فعالیت این آنزیم شود. به منظور بررسی فعالیت آنزیمی پروتئین های fry1 و old101 در شرایط in vitro، نسخه های cdna ژن های fry1 و old101 ابتدا در وکتور ptg19-t و سپس در وکتور بیانی pet28a کلون شدند. بیان پروتئین های نوترکیب old101 و fry1 در سلول های e.coli سویه ی bl21(de3) انجام گرفت و با sds-page تایید شد. پس از انجام تاخوردگی مجدد این پروتئین ها در شرایط in vitro و خالص سازی آن ها، فعالیت آنزیمی شان در حضور ip3 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از بررسی فعالیت آنزیمی این پروتئین ها و فعال بودن هر دو پروتئین در تجزیه ی سوبسترای ip3 حاکی از تاخوردگی صحیح آن ها و انجام موفقیت آمیز پروسه ی تاخوردگی این پروتئین ها در شرایط in vitro بود. نتایج فوق حاکی از کاهش 5/2 برابری فعالیت آنزیمی پروتئین موتانت old101 در مقایسه با پروتئین fry1 بود.