آنزیم های آمیلولیتیک از مهمترین آنزیم ها در صنعت و بیوتکنولوژی بشمار می آیند و امروزه جداسازی این آنزیم ها از میکروارگانیسم های ترموفیل بسیار مورد توجه قرار گرفته است. در این تحقیق دو سویه ترموسی (gh11) و ژئوباسیلوسی (gh6) تولید کننده آنزیم های آمیلولیتیک مورد شناسایی قرار گرفته اند. تست های میکروبی متعدد، مطالعه اسیدهای چرب غشا و آنالیز 16s rdna برای این سویه های ترموفیلی انجام گرفت. تطبیق توالی جزیی 16s rdna سویه ترموسی gh11 با توالی سایر گونه های ترموسی، همولوژی بالای gh11 را با thermus brockianus نشان داد اما تفاوتهای بارز در سایر ویژگیها بویژه دمای رشد معرف گونه جدید ترموسی می باشد. سویه gh6 نیز تفاوتهایی با سایر گونه های ژئوباسیلوسی نشان می دهد. مالتوژنیک آمیلاز یکی از اعضای خانواده آلفا-آمیلاز می باشد که برخلاف سایر آلفا-آمیلازها داخل سلولی است و همچنین فعالیت هیدرولیزی و ترانس گلیکوزیلاسیون را از خود نشان می دهد. ?-سیکلودکسترین سوبسترای ترجیحی آن نسبت به پلولان و نشاسته می باشد. این خصوصیات مالتوژنیک آمیلاز به منظور تهیه اولیگوساکاریدهای شاخه دار و کربوهیدراتهای جدید مناسب است و آن را از سایر آنزیم های معمول خانواده آلفا-آمیلاز متمایز می کند. تاکنون تعداد معدودی مالتوژنیک آمیلاز از سویه های ترموفیلی جداسازی شده است و هیچ گزارشی مبنی بر جداسازی از سویه های ژئوباسیلوسی در دسترس نمی باشد. ژن کدکننده مالتوژنیک آمیلاز از سویه gh6 با استفاده از پرایمرهای طراحی شده تکثیر و در میزبان پروکاریوتی e. coli کلون و سپس تعیین توالی گردید. پلی پپتید متشکل از 1176 باقیمانده آمینواسیدی می باشد و همولوژی بالایی با توالی های مربوطه از سایر گونه ها بویژه thermus sp. im6501 نشان می دهد. به منظور بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم مالتوژنیک آمیلاز، پس از سونیکاسیون و تخلیص جزئی آنزیم از عصاره سلولی، فعالیت آن بر روی سوبستراهای مختلف و اثر دما و phهای مختلف روی فعالیت آمیلولیتیکی و پایداری آنزیم بررسی شد. با توجه به نتایج، مالتوژنیک آمیلاز فعالیت بهینه و حداکثر را به ترتیب در دمای ?c 65 و ?c 70 نشان می دهد، که از فعالیت بهینه مالتوژنیک آمیلازهای جداشده از bacillus subtilis (?c 45)، b. licheniformis (?c 50)، b. stearothermophilus(?c 55) و thermus sp. im6501 (?c 60) بالاتر می باشد. به علاوه پایداری حرارتی این آنزیم نسبت به همتاهای خود که تاکنون گزارش شده اند بطور محسوسی بالاتر بود. مدل ساختار سه بعدی آنزیم با استفاده از برنامه 9v2 modeller و بر اساس ساختار کریستالی thermus sp. im6501 ساخته شد. آنالیز ساختار سوم این آنزیم ها مشخص نمود که تعداد پیوندهای هیدروژنی و سطح در دسترس آنها تفاوت چندانی نشان نمی دهد، اما تعداد پل های نمکی در مدل ارائه شده مالتوژنیک آمیلاز سویه gh6 نسبت به سویه im6501 (الگو) بیشتر می باشد که این می تواند یکی از دلایل پایداری حرارتی و دمای بهینه بالاتر آن باشد.

جنین های سیستی آرتمیا اورمیانا از مقاومترین موجودات یوکاریوتی نسبت به استرس های شدید محیطی می باشند. بخشی از این مقاومت ناشی از وجود مقادیر بالای پروتئین استرسی آرتمین می باشد. آرتمین یک پروتئین 27 کیلودالتونی مقاوم به حرارت و غنی از سیستئین است. فراوانی سیستئین ها و آرایش فضایی درون مولکولی آنها موید این نظر است که آرتمین سیست ها را در مقابل تخریب اکسیداتیو حفاظت می کند و عملکرد آن وابسته به وضعیت ردوکس سلول است. در این مطالعه پس از تخلیص آرتمین از سیست، خصوصیات ساختاری و عملکردی آن مورد مطالعه قرار گرفت. پایداری حرارتی بالای این پروتئین امکان تخلیص آن به روش رسوب دهی با آمونیوم سولفات، انکوباسیون در 70 درجه سانتیگراد به مدت 14 دقیقه و نهایتا کروماتوگرافی تعویض یونی را برای ما فراهم کرد. آنالیزsds-page در شرایط احیایی و غیراحیایی نشان می دهدآرتمین تخلیص شده عمدتا به صورت الیگومر همراه با مقدار اندکی منومر می باشد. تعداد گروه های تیول آزاد و پیوندهای دی سولفید آرتمین به روش اسپکتروسکوپی ellman محاسبه شد. نتایج بیانگر وجود 9 گروه تیول آزاد (7 گروه پوشیده و 2 گروه سطحی) و تنها یک سیستئین درگیر در پیوند دی سولفید، در هر منومر آرتمین بود. داده های این بخش با نتایج آنالیزهای تئوری بر روی مدل ساختار سه بعدی آرتمین مطابقت داشت. براساس این مطالعات حداقل تعداد گروه های –sh سطحی آرتمین سه عدد بود. همچنین ظهور یک بند اضافی kda50 در sds-page غیراحیایی بیانگر وجود پیوند دی سولفید بین مولکولی بود که احتمال می رود بین هر دو منومر مجاور در الیگومر آرتمین موجود باشد. میزان بازیابی فعالیت آنزیم hrp در حضور چپرون احیاء شده (توسط dte و gsh/gssg) بررسی شد. نتایج نشان داد که اعمال شرایط احیایی توانایی چپرونی آرتمین را کاهش می دهد. آرتمین درe. coli سویه bl21(de3) بعنوان پروتئین نوترکیب بیان و با روش کروماتوگرافی تمایلی با خلوص بالا تخلیص شد. پس از تائید بیان آرتمین توسط sds-pageو بلاتینگ، پروتئین نوترکیب تحت شرایط احیایی refold شده و کلیه سیستئین های موجود در آن توسط یدواستامید بلوک شدند. تاثیر پروتئین نوترکیب refold شده و بلوک شده بر روی بازیابی فعالیت آنزیمی کربنیک انهیدراز دناتوره بررسی شد. نتایج بیانگر کاهش فعالیت چپرونی پروتئین آلکیله شده بود. مطالعات فلورسانس ذاتی پروتئین تحت شرایط احیایی نشان دهنده تغییر در ساختار سوم آرتمین بود. پارامترهای ترمودینامیکی آرتمین احیاء شده در حضور دناتورانت از نتایج حاصل از فلورسانس استخراج شد و مشخص گردید که میزان پایداری پروتئین احیاء شده نسبت به شرایط native تفاوت اندکی نشان می دهد.

در این پژوهش، اثر آسکوربیک اسید (asa) و اسپرمیدین (spd) در به تاخیر انداختن پیری گل های شاخه بریده رز رقم ’رویال کلاس‘ بررسی گردید. گل های شاخه بریده رز با غلظت های مختلف asa (2، 4 و 6 میلی مولار) و spd (5 و 10 میلی مولار) و نیز ترکیب 4 میلی مولار asa و 10 میلی مولار spd (asa + spd) به مدت 18 ساعت تیمار گردید. نتایج نشان داد که 4 میلی مولار asa (asa2) بیشترین تاخیر را در پیری گل ها در مقایسه با شاهد (dw) داشت. برخلاف گزارش های قبلی، spd نه تنها ماندگاری گل ها را زیاد نکرد، بلکه باعث پیری زود هنگام گل ها در مقایسه با سایر تیمارها گردید. همچنین، وزن تر و قطر گل و جذب آب گل هایی که با asa2 تیمار شدند، بیشتر از سایر تیمارها بودند. میزان آنتوسیانین، پروتئین، پرولین، پراکسیده شدن لیپیدها (mda)، و نیز فعالیت آنزیم های پراکسیداز (pod)، لیپوکسی ژناز (lox) و سوپراکسید دیسموتاز (sod) گل ها طی 8 روز نگهداری تنها در گل های شاهد آب مقطر (dw) و ساکارز (suc + hqs) و گل هایی که با 4 میلی مولار آسکوربیک اسید (asa2) و 5 میلی مولار اسپرمیدین (spd1) تیمار شده بودند، اندازه گیری گردید. کاربرد 4 میلی مولار asa (asa2) باعث جلوگیری از کاهش آنتوسیانین و پروتئین در طی 8 روز نگهداری گل ها گردید. میزان پرولین در گل های تیمار شده با asaنیز به طور معنی دارای نسبت به شاهد پایین تر بود. استفاده از 4 میلی مولار asa (asa2) با کاهش غلظت mda و فعالیت آنزیم lox وpod و نیز افزایش فعالیت آنزیم sod پیری گل ها را به تاخیر انداخت. بنابراین، asa با نقش آنتی اکسیدانی خود و خنثی سازی رادیکال های آزاد باعث حفظ پایداری غشا سلولی، پروتئین ها و فعالیت بالای sod گردید که می تواند در محلول های نگهدارنده گل های شاخه بریده رز رقم ’رویال کلاس‘ اضافه گردد.

پیر شدن سریع گلچه ها، مهم ترین عامل محدود کننده عمر پس از برداشت کلم بروکلی می باشد. در این پژوهش، اثر غلظت های مختلف پوترسین (put) در به تاخیر انداختن پیری گلچه های دو رقم کلم بروکلی، ’جنرال‘ و ’لیبرتی‘ در ضمن نگهداری طولانی مدت در سردخانه بررسی گردید. گلچه ها با غلظت های 5/0، 1 و 5/1 میلی مولار پوترسین تیمار شدند و از آب مقطر به عنوان شاهد استفاده گردید. پس از تیمار، گلچه ها به سرد خانه با دمای صفر درجه سانتی گراد و رطوبت نسبی 90 درصد منتقل گردیدند. صفاتی چون کیفیت ظاهری، کاهش وزن، میزان کلروفیل و کارتنوئید کل، فنل کل، فلاونوئید کل، نوع فلاونوئید ها (کوئرسیتین کل، کاتچین و کلروژنیک اسید)، ظرفیت آنتی-اکسیدانی، غلظت پروتئین، پراکسیده شدن لیپید ها، فعالیت آنزیم های لیپوکسی ژناز (lox)، سوپراکسید دیسموتاز (sod) و پراکسیداز (pod) در پایان 40 روز نگهداری در سردخانه و نیز دو روز اضافی تر در دمای اتاق اندازه گیری گردید. نتایج نشان داد که تیمار با 5/1 میلی مولار put با به تاخیر انداختن تخریب کلروفیل و پیری، کیفیت ظاهری گلچه های بروکلی را در هر دو رقم ’جنرال‘ و ’لیبرتی‘ بهبود بخشیده است. میزان فنل کل و فلاونوئید کل در پایان انبارداری و نیز دو روز اضافی تر در دمای بالا کاهش یافته است، اما تیمار با put مانع کاهش شدید آنها گردیده است. در پایان نگهداری طولانی مدت در سردخانه و زمانی که گلچه ها به دمای بالا منتقل شدند، میزان کوئرسیتین، کاتچین و کلروژنیک اسید کاهش پیدا کرد، اما تیمار با 5/1 میلی مولار put باعث افزایش معنی دار آن در مقایسه با شاهد گردیده است. میزان پروتئین گلچه های بروکلی در طی پیری کاهش یافت، ولی تیمار با put کاهش بیشتر پروتئین را به تاخیر انداخت. کاربرد put مانع افزایش شدید پراکسیده شدن لیپید های غشاء در ضمن نگهداری طولانی مدت در انبار گردیده است. بعلاوه، مانع از افزایش فعالیت آنزیم های pod و lox و حفظ فعالیت بالای آنزیم sod از آغاز پیری زود هنگام گلچه های کلم بروکلی در طی نگهداری طولانی مدت در سردخانه گردیده است.

پروانه سفید اشجار hyphantria cunea drury یکی از آفات مهم درختان جنگلی، میوه و زینتی در استان گیلان می باشد. آنزیم های گوارشی نقش مهمی در تغذیه حشرات دارند. لاروهای پروانه سفید اشجار از روی درختان چنار در استان گیلان جمع آوری شدند. لوله گوارش و غدد بزاقی لاروها جدا شده و برای انجام آزمایش ها در دمای 20- نگهداری شدند. همچنین همولنف با قطع یکی از پا های کاذب لاروها جمع آوری و در آزمایش مورد استفاده قرار گرفت. اثر ph (4-12)، دما (c°15-75) و مواد شیمیایی روی فعالیت آنزیمهای گوارشی موجود در لوله گوارش، غدد بزاقی و همولنف پروانه سفید اشجار با استفاده از بافرسیترات-فسفات- گلایسین40 میلی مولار مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که phبهینه آلفا-آمیلاز موجود در غدد بزاقی و لوله گوارش 10 بوده و دمای بهینه برای فعالیت این آنزیم در لوله گوارش و غدد بزاقی به ترتیب 55 و 45 درجه سانتی گراد محاسبه شد.ph بهینه برای آلفا-گلوکوزیداز موجود در لوله گوارش و همولنف به ترتیب 8، 7 و برای بتا-گلوکوزیداز لوله گوارش، غدد بزاقی و همولنف به ترتیب 8، 6 و 8 بدست آمد. درجه حرارت بهینه برای فعالیت آنزیم آلفا-گلوکوزیداز در لوله گوارش و همولنف به ترتیب 35 و 45 درجه سانتی گراد و برای آنزیم بتا-گلوکوزیداز لوله گوارش، غدد بزاقی و همولنف به ترتیب 45، 35 و 35 درجه سانتی گراد محاسبه شد. ph بهینه برای فعالیت پروتئاز لوله گوارش11 و دمای بهینه 45 درجه سانتی گراد بدست آمد. نتایج نشان داد که با افزایش سن لاروی میزان فعالیت ویژه آنزیمهای آلفا-آمیلاز، گلوکوزیدازها، گالاکتوزیدازها و پروتئازها افزایش می یابد. همچنین میزان فعالیت ویژه آنزیم های گوارشی در لوله گوارش نسبت به غدد بزاقی و همولنف نیز بیشتر بود. میزان مهارکنندگی بازدارنده های pmsf، tpck، tlck، edta ، یدو استات و یدو استامید روی فعالیت آنزیم پروتئاز به ترتیب 4/44، 4/9، 3/68، 36، 18 و 22 درصد محاسبه شد. نتایج زایموگرام روی ژل نشان داد که آنزیم های آلفا و بتا گلوکوزیداز در لوله گوارش پروانه سفید اشجار هر کدام دارای دو ایزوفرم و آنزیم پروتئاز نیز 3 ایزوفرم را نشان داد. در این تحقیق سمیت باکتری باسیلوس تورینزینسیس روی لاروهای سن 3 و 4 پروانه سفید اشجار مورد بررسی قرار گرفت. همچنین اثرات زیر کشندگی غلظت های ld25، ld50 و ld75 روی فعالیت آنزیم های گوارشی (آلفا-آمیلاز، آلفا- و بتا- گلوکوزیداز و گالاکتوزیداز، پروتئاز) و فنول اکسیداز بررسی شد. نتایج نشان داد که ld50ی حشره کش bt روی لاروهای سن 3 و 4 پروانه ابریشم باف پاییزی به ترتیب 2/3 و 4/7 (میلی گرم ماده فرموله شده بر میلی لیتر) بدست آمد. فعالیت آنزیم های گوارشی در لاروهای تیمار شده با غلظت های زیر کشنده باکتری باسیلوس تورینژینسیس نسبت به شاهد کاهش پیدا کرد. فعالیت آنزیم فنول اکسیداز پس از 48 و 72 ساعت در لاروهای تیمار شده با غلظت ld25 نسبت به شاهد افزایش یافت.

چکیده کنه دولکه ای tetranychus urticae آفت مهم محصولات کشاورزی، با گسترش جهانی محسوب می شود که به تعدادی از آفت کش ها از جمله ترکیبات فسفره آلی مقاوم شده است. در این مطالعه، مکانیسم های بیوشیمیایی مقاومت به کلرپایریفوس در سه جمعیت کنه دولکه ای برای اولین بار در ایران مورد بررسی قرار گرفته است. در ابتدا، کنه ها از استان های اصفهان (isr)، یزد (yz) و گیلان ((gus2 جمع آوری شدند و بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و مولکولی شناسایی گردیدند. سپس سمیت هر سه جمعیت به کلرپایریفوس به روش rcv تعیین شد و نسبت مقاومت در جمعیت های isr (مقاوم) وyz (نیمه مقاوم) در مقایسه با جمعیت gus2 (حساس) به ترتیب 9/176 و 78/9 تخمین زده شد. تعیین فعالیت ویژه و پارامترهای سینتیکی آنزیم های استراز و گلوتاتیون اس- ترانسفراز نشان داد که جمعیت isr بالاترین فعالیت و کارایی کاتالیتیکی را در بین جمعیت ها داراست. تفاوت معنی داری در فعالیت ویژه و پارامترهای سینتیکی آنزیم لیپاز در سه جمعیت مشاهده نشد. همچنین، مقدار mfo نیز در گونه مقاوم بیشتر از سایر جمعیت ها بود. هر چند که اثرات سینرژیستی pbo، dem و tppکه به ترتیب مهارکننده mfo، گلوتاتیون اس- ترانسفراز و استراز می باشند، نشان داد که آنزیم های متابولیکی سهم عمده ای در مقاومت به کلرپایریفوس در جمعیت های isr و yz ندارند. به منظور بررسی نقش غیرحساس شدن آنزیم استیل کولین استراز در مکانیسم مقاومت، پارامترهای سینتیکی استیل کولین استراز و اثرات مهاری تعدادی از مهار کننده ها روی این آنزیم، مورد مطالعه قرار گرفت. km آنزیم با استفاده از سوبسترای استیل تیوکولین آیوداید، به ترتیب 036/0، 041/0، 05/0 میلی مولار برای جمعیت حساس، نیمه مقاوم و مقاوم تعیین شد. به علاوه، ic50 بازدارنده ها روی استیل کولین استراز جمعیت مقاوم از بقیه جمعیت ها بالاتر بود. نسبت غیرحساس شدن استیل کولین استراز با سم کلرپایریفوس به ترتیب 3/23 و 96/2 برای جمعیت مقاوم و نیمه مقاوم تخمین زده شد. همچنین، تغییر در تحرک الکتروفورزی برای استیل کولین استراز جمعیت isr و شدت بیشتر باند مربوطه در حضور کلرپایریفوس اکسان در این جمعیت نسبت به دو جمعیت دیگر، وجود جانشینی اسید آمینه ای در جایگاه فعال و یا نزدیک به آن در این آنزیم را تأیید می کند. کلمات کلیدی: tetranychus urticae، کلرپایریفوس، استیل کولین استراز و آنزیم های سم زدا

زنبور برگخوار ثانوی رز allantus viennensis یکی از آفات مهم رز در استان گیلان می باشد. لاروهای جوان بطور دسته جمعی از پارانشیم برگ تغذیه و با افزایش سن از تمامی برگ تغذیه و فقط رگبرگ اصلی را باقی می گذارند. امروزه از بازدارنده های آنزیم های گوارشی در جهت تولید گیاهان تراریخته مقاوم به آفات استفاده می شود. با توجه به اینکه اولین قدم در راه رسیدن به این هدف شناسایی آنزیم های موجود در لوله گوارش است، به همین دلیل در تحقیق حاضر ویژگی های بیوشیمیایی آلفا- آمیلاز، گلوکوزیدازها، گالاکتوزیدازها و پروتئازهای موجود در دستگاه گوارش این حشره مورد بررسی قرار گرفت. در این تحقیق اثرph (3-12) و دما (10- 80 درجه سانتی گراد) روی فعالیت این آنزیم ها مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که ph بهینه برای فعالیت آنزیم های آلفا- آمیلاز و پروتئاز در لوله گوارش به ترتیب 8 و 10 و ph بهینه آنزیم های آلفا و بتا- گلوکوزیداز و آلفا و بتا- گالاکتوزیداز 6 می باشد. همچنین درجه حرارت بهینه برای فعالیت آلفا- آمیلاز، پروتئاز برابر با 50 و 30 درجه سانتی گراد و دمای بهینه برای آنزیم های آلفا و بتا- گلوکوزیداز و آلفا و بتا- گالاکتوزیداز به ترتیب 40، 50، 60 و 30 درجه سانتی گراد بدست آمد. همچنین فعالیت ویژه این آنزیم ها در لوله گوارش لاروهای سنین 2 تا 5 لاروی و سه قسمت لوله گوارش (روده ی جلوئی، میانی و عقبی) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که با افزایش سن لاروی میزان فعالیت ویژه این آنزیم ها افزایش یافت. فعالیت ویژه این آنزیم ها در روده ی میانی نسبت به روده جلویی و عقبی بیشتر می باشد. میزان مهارکنندگی بازدارنده های edta، tlck، tpck، pmsf، یدواستات سدیم و یدواستیک اسید روی فعالیت آنزیم پروتئاز به ترتیب 79/16، 89/20، 57/18، 85/36، 91/17 و 41/17 درصد محاسبه شد. بنابراین به نظر می رسد که سرین پروتئازها در لوله گوارشی زنبور برگخوار ثانوی رز نقش مهمی در هضم پروتئین ها دارند. نتایج زایموگرام روی ژل نشان داد که آنزیم های آلفا آمیلاز، پروتئاز، آلفا و بتا گلوکوزیداز، آلفا و بتا گالاکتوزیداز در لوله گوارش زنبور برگخوار ثانوی رز به ترتیب 3، 4، 1، 1، 1 و 1 ایزوفرم دارند و پروتئاز عمده لوله گوارش این حشره از نوع سرین پروتئازها می باشد. در این مطالعه بازدارنده-های آلفا- آمیلاز از لوبیا و ماش بوسیله ی ستون کروماتوگرافی تعویض یونی خالص شد. فعالیت بازدارندگی فرکشن های بدست آمده از ستون کروماتوگرافی علیه آلفا- آمیلاز زنبور برگخوار ثانوی رز بررسی شد. بازدارنده های استخراج شده از لوبیا و ماش به ترتیب باعث 44% و 34% مهار فعالیت آلفا- آمیلاز شدند. در این تحقیق نیز آنزیم بتا گالاکتوزیداز موجود در لوله گوارش خالص و وزن مولکولی آن 84 کیلو دالتون به دست آمد. اثر ph، دما، یون ها و پارامترهای km و vmax روی فعالیت آنزیم خاص شده اندازه گیری شد. ph بهینه 6، دمای بهینه 35، و مقدار km و vmax آنزیم خالص شده به ترتیب برابر با 81/0 میلی مولار و 26/0 میلی مولار بر دقیقه بر میلی لیتر به دست آمد. اثر یون ها روی فعالیت آنزیم بتا گالاکتوزیداز نشان داد که hgcl2، cocl2، bacl2، zncl2، و kcl فعالیت این آنزیم را کاهش می دهند و cacl2، mgcl2 و edta فعالیت آنزیم بتا گالاکتوزیداز را در لوله گوارش افزایش داده در حالی که hg2cl2 و mncl2 تاثیری روی فعالیت این آنزیم نداشتند.

خلاصه: تیروزیناز یا پلی فنل اکسیداز (ppo) هر دو فعالیت هیدروکسیلاسیون منوفنل ها به o- دی فنل ها (فعالیت مونوفنلازی) و اکسایش آن به o- کوئینون ها (فعالیت دی فنلازی) را بروز می دهد. مهار تیروزیناز بسیار حائز اهمیت بوده و جستجو برای مهارکننده های جدید تیروزیناز جذاب بوده است. در این تحقیق‏‎‏، برای اولین بار اثر 2-نیتروآنیلین (a)، 3-نیتروآنیلین (b) و 4-نیتروآنیلین (c)، وانیلین (d)، وانیلیل الکل (e)، وانیلیک اسید(f)، همچنین مشتقات سنتزی جدیدی از وانیلین یعنی بیس-وانیلین (g)، 2-نیتروبنزن آمینیوم 4-فرمیل-2-متوکسی فنولات (h)، 3-نیتروبنزن آمینیوم 4-فرمیل-2-متوکسی فنولات (i) و 4-نیتروبنزن آمینیوم 4-فرمیل-2-متوکسی فنولات (j)، روی فعالیت دی فنلازی تیروزیناز با استفاده از دوپامین هیدروکلرید مورد بررسی قرار گرفت. از میان آنها ترکیب c قویترین مهارکننده شناخته شد در حالیکه ترکیبات d، g و h به عنوان فعال کننده شناخته شدند. ic50 این ترکیبات به ترتیب زیر بود: b> e> j = f = a> i> c. ترکیبات a، b و j مهارکننده های رقابتی بودند اما ترکیبات c و i نارقابتی و e و f نیز مهارکننده های مختلط بودند. نتایج نشان داد موقعیت گروههای آمینو و نیترو و قدرت الکترون کشندگی گروههای عاملی در کربن شماره 1 به ترتیب در نیتروآنیلین ها و مشتقات وانیلین در قدرت مهاری آنها مهم است. کلمات کلیدی: تیروزیناز، مهارکنندگی، نیتروآنیلین، وانیلین

پروتئین های لومینسانس، ابزارهای ارزشمندی با کاربردهای فراوان می باشند. تحقیقات مولکولی روی دو گروه پروتئین های بیولومینست، لوسیفرازها و فتوپروتئین ها متمرکز شده است و از بین فتوپروتئین های بیولومینست، خانواده کلنترات بیشترین توجه را به خود جلب نموده است. علاوه بر این خانواده، فتوپروتئین های گروه کتنوفور نیز در حال بررسی است. اخیرا ژن فتوپروتئین نمیوپسین از گونه نمیوپسیس لیدی جدا شده است. در این تحقیق، جهت شناخت بیشتر عملکرد فتوپروتئین نمیوپسین دو جهش n105w با توجه به تریاد کاتالیک his16, tyr82, trp86 در اطراف حلقه اول در موقعیت کربن 6 و جهش s128g با در نظر گرفتن اهمیت شبکه پیوند هیدروژنی در اطراف حلقه 2 کلنترازین در فتوپروتئین های کلنترات، انتخاب شدند. موتانت n105w هیچ گونه فعالیتی از خود نشان نمی دهد و این در حالی است که موتانت s128g در مقایسه با فتوپروتئین طبیعی کاهش چشم گیری در فعالیت نشان می دهد. برای پی بردن به عامل موثر بر این تغییرات، شبیه سازی دینامیک مولکولی استفاده و نتایج حاصل با نتایج به دست آمده از شبیه سازی اکورین های سمی سنتتیک مقایسه شد. نتایج نشان می دهد که کاهش فعالیت در موتانت s128g می تواند مربوط به تغییرات حرکات ساختاری کلنترازین و ناحیه حفره و نیز تغییر در میانکنش لیگاند و پروتئین باشد. با توجه به نتایج حاصل می توان اینگونه بیان کرد که خواص دینامیک ساختاری پروتئین و لیگاند، نقش مهمی در فعالیت فتو پروتئین ها بازی می کند و خصوصیات نشر نوری از پارامتر مختلفی تاثیر می پذیرند.

اغلب ارقام تجاری جنس مرکبات نسبت به تنش دمای پایین آسیب پذیرند. در این پژوهش تغییرات، فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مورفولوژیکی برخی درختان جوان و میوه مرکبات تحت تنش سرما و یخبندان بررسی شد. در آزمایش اول، واکنش درختان جوان پیوندی (دو ساله) پرتقال تامسون ناول و نارنگی پیج روی سه پایه نارنج، سیترنج و پونسیروس پس از طی اعمال تیمارهای دمایی (9، 6، 3، 0، 3- ، 6- وc ? 2 ± 25 به عنوان شاهد) و در مرحله بازگشت از تنش مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج آزمایش بیانگر آن بود که در تامسون ناول و پیج تنزل دما در کاهش کلروفیل، محتوی آب برگ و افزایش پراکسیداسیون لیپید، نشت یونی، پرولین، کربوهیدرات محلول، کاروتنوئید کل، فنل کل، فعالیت آنزیم های سوپراکسایددیسموتاز و پراکسیداز برگ تاثیر گذار بود. در تامسون ناول و پیج، پایه پونسیروس موجب کاهش پراکسیداسیون لیپید و افزایش فنل کل برگ شد. پایه پونسیروس در رقم نارنگی پیج، بر افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانی (تا میانگین 87/72 %) و فعالیت آنزیم کاتالاز (تا مقدار 431/0 میلی گرم در گرم وزن تر برگ) نیز تاثیر گذار بود (p?0.01). با توجه به نتایج، نارنگی پیج روی پایه پونسیروس در مقایسه با تامسون ناول نسبت به تنش یخبندان متحمل تر بود. حساسیت میوه مرکبات نسبت به تنش دمای پایین در ارقام مختلف می تواند متفاوت از درجه آسیب پذیری بخش های هوایی آنها باشد. در آزمایش دوم اثر تنش دمای پایین (3، 0، 3- ، 6- وc ? 15 به عنوان شاهد) بر تغییرات کیفی میوه تامسون ناول، نارنگی پیج و انشو بررسی شد. برهمکنش اثرات ژنوتیپ و دما در هر سه میوه نشان داد که میزان کاروتنوئید کل، فنل کل و ظرفیت آنتی اکسیدانی نسبت به شاهد در سطح یک درصد افزایش داشت. در مرحله بازگشت از تنش یخبندان در میوه تامسون ناول تلخی گوشت تا 8 برابر شاهد افزایش داشت. در میوه های مورد مطالعه اعمال تنش دمای 6- درجه سانتی گراد موجب 7 برابر شدن نشت یونی پوست میوه نسبت به شاهد گردید که در مرحله بازگشت از تنش، پوسیدگی میوه را تا 70 % افزایش داد. همچنین در طی تنش دمای پایین فلاونوئید کل، فعالیت آنزیم سوپراکساید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز گوشت میوه ارقام مورد مطالعه نسبت به نمونه های شاهد افزایش معنی داری نشان داد. در مجموع، می توان نتیجه گیری کرد که میوه تامسون ناول، انشو و پیج با افزایش پتانسیل آنتی اکسیدانی قادر به تحمل تنش سرما (دمای بالای صفر درجه) است. همه ارقام مورد مطالعه در این آزمایش حساس به تنش یخبندان (دمای زیر صفر درجه سانتی گراد) بوده و میوه تامسون ناول نیز به دلیل بروز تلخی، نسبت به تنش مذکور حساسیت بیشتری نشان داد. در بررسی تیپ های طبیعی منطقه شمال ایران به منظور استفاده در برنامه های اصلاحی مقاومت به یخبندان در پژوهش بعدی، میزان تحمل پذیری به تنش یخبندان (0 ، 3- ، 6- و c ? 2 ± 25 به عنوان شاهد) چهار تیپ بذری مرکبات سیاورز، شل محله، معلم کوه و نارنج آف تایپ مورد ارزیابی قرار گرفت. در برهمکنش اثرات دما و ژنوتیپ، افزایش خسارت ساقه، پراکسیداسیون لیپید، نشت یونی، آب گزیدگی، ظرفیت آنتی اکسیدانی و کاهش محتوی آب و رنگ سبز برگ، معنی دار بود (p?0.01). بر اساس تجزیه داده ها تنش دمای پایین، مقدار کربوهیدرات و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز را در c?3- و پرولین و سوپراکساید دیسموتاز را در صفر درجه سانتی گراد افزایش داد. با توجه به شاخص های اندازه گیری شده در بین تیپ های مورد مطالعه معلم کوه نسبت به تنش یخبندان متحمل تر بود.

آلفا-آمیلازها در آهارگیری نشاسته و مشتقات نامحلول آن از روی پارچه پنبه ای پس از فرایند بافندگی به گستردگی استفاده می شوند. مزایای استفاده از روش آنزیمی سرعت، اختصاصی عمل نمودن و مزایای محیط زیستی آن است. باکتری مورد استفاده در این مطالعه سویه bacillus sp. kr-8104 است که از میان مجموعه ای از سویه های باکتریایی جداشده بومی در دانشگاه گیلان و دانشگاه تربیت مدرس انتخاب شده بود. حداکثر تولید آنزیم در دمای ?c45، 6-5ph= و سپری شدن 35-30 ساعت پس از کشت در محیط تولیدی که شامل فضله مرغ و پودر سویا به عنوان منابع نیتروژنی بود بدست آمد. آنزیم با سولفات آمونیوم %85 اشباع تغلیظ و برای آزمایشات بعدی بهینه شد. در این مطالعه بهینه سازی آهارگیری آنزیمی پارچه پنبه ای با آلفا-آمیلازی که مستقل از کلسیم و آلودگی های یونی فلزی است و همچنین دارای فعالیت بالایی در شرایط اسیدی می باشد انجام شد. آهارگیری بهینه بر مبنای درصد کاهش وزن و درجه تگوا در دمای ?c60، 6ph=، زمان 30 دقیقه و مقدار آنزیم معادل باiu 5/4 بدست آمد. با توجه به کارایی بالای این آنزیم در شرایط اسیدی، آهارگیری آنزیمی و اسیدی به صورت همزمان میسر شد. علاوه بر آن آهارگیری آنزیمی و demineralization می توانند در ph های پایین و یک مرحله انجام شوند. نتایج نشان دادند که آهارگیری آنزیمی می تواند در محدوده وسیعی از دما بین 70-30 درجه سانتیگراد به طور مطلوبی انجام شود. به کارگیری نمک های کلرید باریم در هر دو غلظت 5 و 10 میلی مولار و همچنین کلرید پتاسیم در غلظت 10 میلی مولار سبب افزایش فعالیت آنزیم و راندمان آهارگیری می گردید. به علت اینکه راندمان آهارگیری تحت تاثیر edta و اکثر آلودگی های یونی فلزی نامطلوب مانند سختی ها قرار نمی گیرد می توان از شلاتورها به منظور حذف یون های مزاحم در حمام آهارگیری بهره جست. نتایج فوق سبب بهبود در آهارگیری آنزیمی و فرایندهای بعدی پارچه پنبه ای می گردد که می تواند موجب ذخیره سازی موثر در انرژی، زمان و هزینه های صنعت نساجی شود.

کفشدوزک خربزه با نام علمی epilachna chrysomelina (f.) یکی از مهم ترین آفات گیاهان خانواده کدوئیان است. در تمام سنین لاروی و حشره کامل از گیاه میزبان تغذیه و خسارت جدی را به این محصولات وارد می سازد. مطالعه آنزیمهای گوارشی و اثر بازدارنده ها روی آن برای ایجاد گیاهان تراریخته مقاوم به آفات مهم و ضروری می باشد. به همین دلیل در تحقیق حاضر ویژگی های بیوشیمیایی آنزیم های آلفا-آمیلاز، آلفا و بتا-گلوکوزیداز و گالاکتوزیداز و پروتئاز در کفشدوزک خربزه جمع آوری شده از استان گیلان مورد بررسی قرار گرفت. فعالیت بهینه کربوهیدرازها و پروتئازهای گوارشی در phها و دماهای مختلف بررسی و نتایج نشان داد که ph بهینه آنزیم آلفا-آمیلاز 4 و دمای بهینه آن 50 درجه سلسیوس می باشد. اندازه گیری پارامترهای سینتیکی آنزیم آمیلاز نشان داد که km بدست آمده 69/0 میلی گرم بر میلی لیتر می باشد. هم چنین نتایج زایموگرام آلفا-آمیلاز روی ژل نشان داد که یک ایزوفرم از این آنزیم در دستگاه گوارش این حشره وجود دارد. در این تحقیق اثر بازدارنده های استخراج شده از بذور خلر(lathyrus sativus l.)، شبدر (trifolium alexandrium l.)، ذرت (zea mays l.)، باقالا (faba vulgaris l.)، عدس(lens culinaris medic.)، لوبیا چشم بلبلی (vigna unguiculata l.)، لوبیا قرمز (phaseolus vulgaris l.) و ماش (vigna radiate l.) روی آنزیم آمیلاز کفشدوزک خربزه بررسی شد. نتایج نشان داد که در بین این مهارکننده ها، بازدارنده های استخراج شده از لوبیا قرمز (phaseolus vulgaris l.) و ماش (vigna radiate l.) با استفاده از کروماتوگرافی تبادل یونی قادر به مهار آلفا آمیلاز این آفت بودند. ph و دمای بهینه آنزیم های آلفا و بتا-گلوکوزیداز موجود در لوله گوارش به ترتیب 5 و 40 درجه سلسیوس و نیز ph و دمای بهینه آنزیم های آلفا و بتا-گالاکتوزیداز به ترتیب 5 و 40 درجه سلسیوس بدست آمد. همچنین در این تحقیق ph و دمای بهینه برای فعالیت پروتئاز در لوله گوارش به ترتیب 5 و 30 درجه سانتی گراد محاسبه شد. میزان مهارکنندگی بازدارنده های edta، tlck، tpck، pmsf و یدواستات سدیم روی فعالیت آنزیم پروتئاز به ترتیب 93/18، 04/19، 27/22، 05/26 و 32/44 درصد محاسبه شد که نشان دهنده غالب بودن سیستئین پروتئازها به عنوان پروتئازهای غالب در لوله گوارش این حشره می باشند. اندازه گیری فعالیت کربوهیدرازها و پروتئازها در لوله گوارش سنین 2، 3 و 4 لاروی و حشرات کامل نر و ماده نشان داد که بیشترین فعالیت این آنزیم در لاروهای سن 3 بوده و فعالیت این آنزیم در حشرات نر و ماده اختلاف معنی داری با هم ندارند. در این تحقیق نیز آنزیم بتا-گلوکوزیداز خالص و وزن مولکولی آن 50 کیلو دالتون به دست آمد و اثر ph، دما، یون ها و پارامترهای km و vmax روی فعالیت این آنزیم اندازه گیری شد. ph بهینه 5، دمای بهینه 35 درجه سلسیوس و مقدار km وvmax آنزیم بتا گلوکوزیداز در لوله گوارش، به ترتیب برابر با 019/0 میلی مولار و 064/3 میلی-مولار بر دقیقه بر میلی لیتر به دست آمد. اثر یون ها روی فعالیت بتا-گلوکوزیداز نشان داد که hgcl2، hg2cl2، zncl2، cacl2،mgcl2 ، edta و kcl فعالیت آنزیم را کاهش می دهند و mncl2و bacl2 فعالیت آنزیم بتا-گلوکوزیداز را افزایش داده، در حالی که cocl2 تاثیری روی فعالیت این آنزیم نداشتند.

در این پژوهش، اثر سالیسیلیک اسید (sa) و آسکوربیک اسید (asa) در تقویت سیستم آنتی اکسیدانی و افزایش بقاء گیاهچه های ریزازدیاد شده گل جعفری(tagetes patula) در طی سازگاری بررسی شده است. نتایج نشان داد که درصد بقاء گیاهچه های که به محیط کشت آنها 1 میلی مولار sa و100 میلی گرم asa اضافه شده بود، بیشتر از سایر تیمارها بوده است. نتایج همچنین تغییرات در میزان پروتئین و فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی در برگ ها و ساقه گیاهچه ها ریزازدیاد شده در طی سازگاری را نشان داد. بیشترین میزان پروتئین و فعالیت آنزیم های سوپر اکسیددیسموتاز (sod)، پراکسیداز (pod)، کاتالاز (cat) و آسکوربات پراکسیداز (apx) در روز هفتم از انتقال به محیط کشت برون شیشه ای مشاهده شده است، اما پس از آن این میزان کاهش پیدا کرد. افزودن sa و asa به محیط کشت درون شیشه ای باعث افزایش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی در برگ و ساقه گیاهچه ها شده است و بالاترین سطح فعالیت زمانی مشاهده شد که هر دو ترکیب به محیط کشت درون شیشه ای اضافه شده است. در مجموع، نتایج پیشنهاد می کند که افزایش فعالیت آنزیم های آنتی آکسیدانی و پروتئین کل در گیاهچه ها در طی سازگاری نتیجه واکنش به تنش اکسیداتیو در طی سازگاری است و افزودن sa و asa به محیط کشت درون شیشه ای توانست با تقویت سیستم آنتی اکسیدانی آنزیمی باعث کاهش تلفات گیاهچه ها شود.

ماهی حوض ((carassius auratus auratus از ماهیان آب شیرین، خانواده کپور ماهیان، راسته کپور شکلان بوده و جزء اولین ماهیان اهلی شده و آکواریومی به حساب می آید. به منظور مطالعه میزان ویتلوژنین پلاسمای القاء شده توسط تیمارهای 17بتا-استرادیول، بیس فنول a (bpa)، نفتالن و بوتاکلر، نمونه برداری از مرکز پرورش ماهی در جاده جیرده-شفت انجام شد. بررسی حاضر طی دو آزمایش مجزا انجام گرفت. نخست تیمارهای bpa، نفتالن و بوتاکلر با دوزهای µg/l 500، µg/l 200، µl/l 28/0 طی مدت 15 روز به آکواریوم های حاوی ماهی حوض اضافه گردیدند و سپس خونگیری در روز های پنجم، دهم و پانزدهم آزمایش انجام شد و پلاسمای بدست آمده جهت انجام مراحل بعدی آزمایش در ?? 20- نگهداری شد. در آزمایش دوم، تیمارهای 17بتا-استرادیول، bpa، نفتالن و بوتاکلر با دوزهای mg/ml 5/0، mg/kg 50، mg/kg 50، µl 20، مستقیما به ماهی ها تزریق شدند و پس از 48 ساعت خونگیری صورت گرفت و پلاسمای بدست آمده مطابق آزمایش اول نگهداری شد. با استفاده از تست alp میزان po4-3 و ویتلوژنین هر یک از تیمارها محاسبه گردید. نتایج بدست آمده از آزمایش اول نشان داد بین مقادیر ویتلوژنین تیمارها و گروه کنترل اختلاف معنی دار وجود دارد (p<0.05). در بین تیمارها ابتدا 17بتا-استرادیول و سپس bpa بیشترین میزان ویتلوژنین را به خود اختصاص داد. از لحاظ آماری بین دو تیمار نفتالن و بوتاکلر اختلاف معنی داری وجود نداشت. نتایج آزمایش دوم اختلاف معنی دار بین گروه کنترل و تیمارها را نشان داد (p<0.05)، در حالی که بین دو تیمار bpa و نفتالن اختلاف معنی داری وجود نداشت. با توجه به نتایج به دست آمده در این بررسی bpa ، نفتالن و بوتاکلر با القاء سنتز ویتلوژنین در هر دو آزمایش نشان دادند که می توانند به عنوان edc در نظر گرفته شوند.

جنس euphrasia l. متعلق به خانواده orobanchaceae می باشد. اعضای این جنس، گیاهان نیمه انگلی یکساله و یا دو ساله ای هستند که در نواحی معتدل مناطق نیمکره شمالی و جنوبی پراکنده می باشند. این جنس دارای 350 گونه در جهان و 6 گونه در ایران می باشند. مطالعه حاضر به منظور تشخیص روابط فیلوژنی گونه های این جنس در ایران بر اساس داده های حاصل از توالی قطعات its و trnl-f صورت گرفت و همچنین بعضی از صفات مرفولوژیک برای بررسی تکامل صفات و تشخیص صفات سین آپومورف انتخاب شدند. مطالعات مولکولی جایگاه این گونه ها را در سطح بخشه و زیربخشه در فلورا ایرانیکا تایید کرد به جز euphrasia salisburgensis بر اساس فلورا ایرانیکا در بخشه angustifulia قرار می گیرد، در حالی که مطالعات مولکولی نشان داد که این گونه در بخشه euphrasia قرار می گیرد. بر اساس فلورا ایرانیکا دو گونه euphrasia pectinata و euphrasia juzepczukii در بخشه euphrasia و زیر بخشه cilliatae قرار می گیرند. مطالعات مولکولی نشان داد که این در گونه با ارزش حمایتی 81% گروه خواهری محسوب می شوند. دو گونه euphrasia sevanensis و euphrasia petiolaris با حمایت 100% گروه خواهری تشکیل یک گروه خواهری را می دهند و بر اساس فلورا ایرانیکا این دو گونه در بخشه euphrasia ، زیر بخشه cilliatae و سری petiolaris قرار می گیرند. euphrasia hirtella با حمایت 100% در بین اعضای بخشه euphrasia در اروپا قرار می گیرد. بررسی تکاملی صفات برای تشخیص صفات سین آپومورف نشان داد که ویژگیهای ریخت شناسی در این جنس به دلیل وجود دامنه بالایی از تغییرات، ارزش تاکسونومیکی ندارند و هیچ صفت سین آپومورفی در این جنس مشاهده نشد

نمیوپسین پروتئینی متعلق به خانواده ی بزرگ پروتئین های اتصالی به کلسیم از نوع ef-hand و از گروه فتوپروتئین های وابسته به ca2+ می باشد که به طور گسترده ای به عنوان کاوشگر داخل سلولی کلسیم، بیوسنسور، نشانگر آنالیز زیستی برای مطالعات immunoassay و … استفاده می شود. یکی از ویژگی های تمامی اعضای خانواده ی ef-hand وجود موتیف ساختمانی مارپیچ-لوپ-مارپیچ می باشد. در این تحقیق برای نخستین بار تغییرات کانفورماسیونی پروتئین نمیوپسین در حضور غلظت های مختلف کلسیم مورد مطالعه قرار گرفت. پروتئین نمیوپسین در باکتری e. coli سویه bl21 بیان شد و به کمک ستونni-nta agarose تخلیص گردید. کلسیم توسط edta یا رسوب با تری کلرو استیک اسید از ساختار پروتئین حذف شد. مطالعات far-uv cd، فلوئورسانس و کالریمتری توسط jasco-715 spectropolarimeter،ls55 fluorescence spectrophotometer و nano dsc-?انجام شد. طیف far-uv cd تمامی اشکال دارای کلسیم با آپو نمیوپسین تفاوت چندانی نشان نمی دهد، اما به نظر می رسد تاثیر غلظت های پایین و بالا بر ساختار کمی متفاوت است. فلوئورسانس ذاتی در حضور کلسیم کاهش می یابد، درحالیکه فلوئورسانس ans افزایش می یابد. این نتایج نشان می دهد نمیوپسین در حالت آپو نسبت به ساختار دارای کلسیم کانفورماسیون بسته تری دارد. هم چنین شیب اشترن-ولمر (حاصل از خاموشی فلوئورسانس در حضور اکریل-امید) برای نمیوپسین دارای کلسیم نسبت به آپو بیشتر است، بنابراین انعطاف پذیری (در دسترس بودن آمینواسید تریپتوفان) در ساختار دارای کلسیم افزایش می یابد. هضم پروتئین در حضور ترمولیزین نشان داد پروتئین در حالت آپو نسبت به ترمولیزین مقاوم تر است و کمتر هیدرولیز می شود. نتایج دینامیک مولکولی نیز نشان می دهد در میان پنج باقیمانده تریپتوفان موجود در ساختار نمیوپسین، تغییرات ریز محیط اطراف رزیدو 21 از اهمیت بیشتری برخوردار است. مطالعات کالریمتری بیانگر افزایش پایداری حرارتی پروتئین در حضور کلسیم است. نتایج تجربی کسب شده در این تحقیق نشان از آن دارد که برخلاف اکثر پروتئین های متصل شونده به کلسیم، با اتصال کلسیم انعطاف پذیری ساختار نمیوپسین در کل افزایش می یابد که با عملکرد این پروتئین تطابق کامل دارد.

جلبک سبز تک سلولی تاژک دار dunaliella ، متعلق به خانواده chlamydomonaceae است . این جلبک به علت فقدان دیواره سلولزی و ساده بودن ساختار یاخته ای می تواند به عنوان یک سیستم مدل در مطالعات فیزیولوژی گیاهی مورد توجه قرار گیرد. حضور فلزات سنگین به عنوان آلاینده در محیط عمدتا" به علت اختلال در عمل غشاء و اثر رقابتی با عناصر ضروری موجب کاهش جذب این عناصر و همچنین القاء تنش اکسیداتیو و بروز اثرات سمی در سلول ها می شوند. به منظور بررسی رشد و پاسخ سیستم آنتی اکسیدانی جلبکdunaliella sp. به تنش فلز سنگین سرب، آزمایش بلند مدتی با غلظت های 40، 60 و 80 میکرومولار نمک نیترات سرب با سه تکرار در اتاقک کشت با دمای ? c2± 25، شدت نوری 2000 تا 3000 لوکس و فتوپریود 12ساعت نور و 12 ساعت تاریکی به مدت 20 روز انجام شد. نتایج نشان داد ، که با افزایش غلظت سرب در محیط کشت، سنتز کلروفیلa و کلروفیل کل و متعاقب آن نرخ رشد به معنی توانایی تقسیم سلول ها، کاهش یافت. همچنین مقدار مالون دی آلدهید (mad) به عنوان شاخص تنش های زیستی ، قدرت خنثی کنندگی رادیکال های آزاد (dpph)، محتوای پروتئین کل، میزان بتاکاروتن، فعالیت آنزیم های cat و pod با افزایش غلظت سرب افزایش معنی دار یافت. اما فعالیت آنزیم های sod و ppo، میزان فنل کل و قدرت آنتی اکسیدان های احیا کننده فریک (frap) در غلظت 40 میکرومولار افزایش معنی دار داشت.

فتوپروتئین ها، پروتئین های تنظیم شونده به کلسیم هستند که نور ساطع می کنند. تاکنون، بیشترین بررسی ها روی فتوپروتئین های کلنترات مثل اکورین و اوبلین انجام شده است و هیچ اطلاعی در مورد مکانیسم فتوپروتئین های کتنوفور از جمله نمیوپسین و معماری جایگاه اتصال آن به کلنترازین وجود ندارد. در این تحقیق بعضی از آمینواسیدهای مهم درگیر در حفره اتصال کلنترازین نمیوپسین توسط رزیدوهای متناظر با فتوپروتئین های بسیار شناخه شده فوق جایگزین گردید. بدین منظور جهش های w59k، l127w و v183t با در نظر گرفتن شبکه پیوند هیدروژنی در اطراف حلقه های مهم کلنترازین انجام شد. بر خلاف انتظار، غیر از جهش یافته v183t که 75% فعالیت نمیوپسین وحشی را دارا بود، سایر جهش ها هیچ گونه فعالیتی از خود نشان ندادند. جهش یافته v183t در غلظت های بالاتری از کلسیم فعال می شد و طول موج حداکثر طیف بیولومینسانسی آن، حدود 20 نانومتر نسبت به فرم وحشی جابجایی آبی داشت (470 در مقابل 490 نانومتر). احتمالا کاهش سطح در دسترس بعضی از آمینواسیدهای کوئوردینه شونده با کلسیم باعث کاهش حساسیت به کلسیم این جهش یافته شده است. این جهش یافته در سایر خصوصیات تفاوتی با نمیوپسین طبیعی نداشت. اسپکتروسکوپی cd و فلوئورسانس و مدلسازی ملکولی نشان داد که تغییرات ساختاری در جهش یافته ها به ویژه l127w نسبت به فرم وحشی محسوس است. عدم فعالیت در موتانت های w59k و l127w و کاهش فعالیت در موتانت v183t، دلیلی بر وجود این آمینواسیدها در حفره اتصال یا نقششان در مکانیسم عمل است. به نظر می رسد چینش آمینواسیدها در حفره اتصال به کلنترازین مربوط به دو خانواده کلنترات و کتنوفور نسبت به هم متفاوت هستند طوری که جایگزینی این آمینواسیدها با آمینواسیدهای متناظرشان از خانواده دیگر (نظیر جهش های این تحقیق) یکپارچگی مورد نیاز جهت عملکرد بیولومینسانسی آن را از بین برده و چنان تغییرات ساختاری را منجر می شود که باعث غیرفعال شدن یا کاهش فعالیت این پروتئین می گردد.

پروتئازها مهمترین گروه آنزیم های صنعتی هستند که حدود 60% فروش جهانی محصول آنزیمی را در برمی گیرند و در صنایع مختلفی چون داروسازی و پزشکی، شوینده ها، چرم سازی، غذایی مورد استفاده قرارمی گیرند. آنزیم های پروتئولتییک به طور گسترده ای در مدیریت کمبود آنزیم و کاربردهای درمانی استفاده می شوند. این آنزیم ها همراه با عوامل ضد التهابی غیراستروئیدی تجویز می شوند. یکی از این آنزیم ها متالواندوپپتیداز خارج سلولی است که توسط سویه های مختلف سراشیامارسسنس ترشح می-شود. این متالوپروتئاز اولین بار از یک سویه 15-e s.marcescens از لوله گوارش لارو کرم ابریشم جداسازی و خالص سازی گردید و سراپپتاز (سراپپتیداز، سراشیاپپتیداز) نامیده شد. آلکالن متالوپروتئازها به طور طبیعی توسط سویه های مختلف سراشیا ترشح می شوند و منجر به تولید یکی از اولین آنزیم هایی شدند که به صورت تجاری تولید و در صنایع دارویی مورد استفاده قرارگرفت. سراپپتاز تمایل خاصی به مولکول های پروتئینی مرده داشته و هضم و شکست پروتئین ها را در بدن برعهده دارد. آنزیم با پاکسازی فیبرها از خون و سیستم لنفاوی، پاکسازی موکوس از طریق کاهش سلول های نوترفیلی و از بین بردن التهاب از بدن به سیستم ایمنی کمک می کند تا عملکرد بهتری داشته باشد. این آنزیم در درمان شریان مسدود شده در بیماری های کرونر، پاکسازی پلاک های شریانی، کاهش میگرن و بیماری های قلبی- عروقی مفید است. در این پژوهش ابتدا ژن پروتئاز که متالوپروتئاز را کد می کند، با پرایمرهایی که بر اساس ژن متالوپروتئاز s.marcescens e-15 طراحی شد، شناسایی وتعیین توالی گردید. این قطعه آلکالن متالوپروتئاز خارج سلولی وابسته به zn با وزن مولکولی تقریبا kda50 را کد می کند. قطعه ی dna 97 درصد هومولوژی با ژن متالوپروتئاز سراشیامارسسنس داشت. پروتئین کد شده از این ژن با سراپپتیداز سراشیامارسسنس 99 درصد مشابهت داشت. این متالوپروتئاز با رسوب دهی سولفات آمونیوم، دیالیز، فیلتراسیون و کروماتوگرافی deae-sepharose به صورت جزئی خالص سازی و تعیین ویژگی گردید. فعالیت پروتئولیتیک آن با استفاده از روش skim milk agar و زایموگرافی تعیین گردید. فعالیت پروتئاز در دمای 55-50 و محدوده ph( 10-8 ) بهینه می باشد. اثر ترکیبات مختلف از جمله مهارکننده ها و یون های فلزی روی فعالیت پروتئاز تعیین شد و پارامترهای کینیتیکی آن انداره گیری گردید. آنزیم روی نانوژل های کیتوزان به عنوان حامل انتقال پروتئاز تثبیت شد، سپس ویژگی های فیزیکوشیمیایی(sem ، ftir، دمای اپتیمم، ph اپتیمم) و پایداری گرمایی آنزیم تثبیت شده مورد بحث و بررسی قرارگرفت.

zn -متالوپروتئاز ها یک گروه از آنزیم های متعلق به خانواده متالوپروتئاز ها می باشند. اخیرا با توجه به کاربرد این آنزیم ها در صنعت به-خصوص در صنایع غذایی، همچنین پزشکی و نیز طراحی دارو ها بسیار مورد توجه بوده اند. الاستاز سودوموناس آئروجینوزا و ترمولیزین حاصل از باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس جزو این خانواده بوده و دارای مشابهت بالایی در توالی و همچنین همولوژی بالایی دارند. این آنزیم ها دارای یک یون روی در جایگاه فعال اند که برای فعالیت ضروری می باشد، الاستاز در لوپ اتصالی به کلسیم دارای 1 یون کلسیم و ترمولیزین دارای 4 یون کلسیم می باشد، به علت وجود این یون های کلسیم ترمولیزین پایداری حرارتی بالاتری را دارا می باشد، در این تحقیق کلسیم های 1 ،2 و 4 این آنزیم با لوپ موجود در الاستاز که حاوی کلسیم می باشد جایگزین شد و بدین شکل پروتئین کایمر طراحی و سنتز شد. در مطالعات قبلی، ژن این آنزیم از گونه ی باکتریایی سودوموناس آئروجینوزا (ptcc 1430) جداسازی، کلون و بیان گردیده بود.در طی آزمایشات نتایج نشان دادند که بیان پروتئین در دمای 30 درجه ی سانتی گراد، با 4 ساعت انکوباسیون بعد القاء در غلظت یک میلی مولار iptg افزایش یافته است، در این مرحله به منظور بهینه کردن مدت زمان بیان در فواصل مختلف از باکتری های القاء شده نمونه برداری شد، سپس بیان پروتئین کایمر درون e. coli سویه ی bl21 صورت گرفت و در نهایت پس از تائید بیان پروتئین کایمر توسط sds-page، عملکرد پروتئین کایمر نیز مورد بررسی قرار گرفت. سپس به تعیین ویژگی های الاستاز وحشی و پروتئین کایمر نظیر ph مطلوب، دمای مطلوب، شرایط بیانی مطلوب (میزان بیان در دما ها، زمان ها) پرداخته شد. اثر دما و ph های مختلف بر روی فعالیت پروتئین کایمر، فعالیت بهینه را درc°70 نشان داد که نسبت به الاستاز وحشی که تعیین خصوصیت شده بود،10 درجه به سمت دما های بالاتر شیفت پیدا کرده بود و ph اپتیمم برای فعالیت آنزیم 8.5 بود که نسبت به نو ع وحشی آن تغییر نیافته بود. در نهایت با استفاده از همولوژی مدلینگ مدل الاستاز وحشی، پروتئین کایمر برای استفاده در محاسبات تئوری از قبیل dccm, rmsd, rmsf و میانکنش های الکترواستاتیک ساخته شد.

دو آفت مهم منطقه پروانه برگ خوار توت و ابریشم باف پاییزی می باشند که هر ساله خسارت شایان توجه ای را به توتسنان ها و مناطق جنگلی گیلان وارد می کند در جهت کنرل آنها ادر پژوهش از ترکیب 4-هگزیل رسورسینول استفاده شد ومیزان تاثیر این ترکیب روی فعالیت آنزیم های موجود در سیستم ایمینی وآنزیم های م زدای حشرات مورد بررسی قرار گرفت علاو بر آن این آنزیم توسط ستون های خالص سازی ژل فیلتراسیون و تبادل یونی نیز خالص شد و ویژگی های بیو شیمیایی ارزیابی شد و میزان مهار کنندگی چندین بازدارنده فنل اکسیدازی روی آنزیم خالص شده اندازه گیری شد و مکانسیم بازدارندگی آنها نیز بدست امد.

zn- متالوپروتئاز ها گروه مهمی از پروتئاز ها می باشند. که کاربرد های مختلفی در سنتز پپتید، پردازش پروتئین، صنایع غذایی، داروئی و دترژنت های صنعتی دارند. این دسته از آنزیم ها پیوند های پپتیدی را در محیط های آبی هیدرولیز کرده و همچنین در محیط های غیر آبی سنتز می شوند. پروتئازها به عنوان بیوکاتالیست برای سنتز پپتید نیاز به پایدار شدن در حضور برخی از حلال های آلی دارند. الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا و ترمولیزین حاصل از باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس مهمترین متالوپروتئازها ی باکتریایی کاربردی هستند که شامل یک یون روی برای کاتالیز و به ترتیب دارای یک و چهار یون کلسیم برای پایداری می باشند. در این تحقیق یک لوپ سطحی در الاستاز که تنها به یک یون کلسیم متصل است با لوپ متناظر در ترمولیزین که به سه یون کلسیم متصل می گردد، جایگزین گردید. بنابراین الاستاز کایمری می تواند به سه یون کلسیم متصل شود. بهترین شرایط بیان آنزیم کایمر و وحشی به ترتیب 2 و 10 ساعت تحت شرایط القاء با 1 میلی مولار iptg تعیین گردید و سپس خالص سازی آنزیم ها با استفاده از ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی -deaeسفاروز انجام گردید و سپس فعالیت کاتالیزوری (شکستن سوبسترا ی کازئین) آنزیم ها در حضور غلظت های مختلف (v/v%) از حلال های آلی (اتانول، متانول، ایزوپروپانول، اتیلن گلیکول، گلیسرول و دی متیل فرمامید) صورت گرفت. آنزیم الاستاز فعالیت بیشتری را نسبت به آنزیم کایمر در حضور اتیلن گلیکول، متانول، اتانول و دی متیل فرمامید نشان داد در حالی که آنزیم کایمر در حضور گلیسرول و ایزوپروپانول فعالیت بیشتری را دارا بود. هرچند هر دو آنزیم در تمامی حلال های آلی بسیار فعال بودند، که اشاره بر این دارد که ناحیه سطحی مهندسی شده مسئول برای پایداری/ فعالیت آنزیم الاستاز در حضور حلال های آلی نمی باشد. سپس پارامتر های سنتیکی km و kcat آنزیم با سوبسترا کازئین در حضور و غیاب 50 (%v/v) حلال های آلی مختلف که در بالا ذکر شدند، تعیین گردید. در عدم حضور حلال های آلی هر دو پارامتر km و kcat آنزیم کایمر در قیاس با آنزیم وحشی به ترتیب 30 و 3% بهبود یافته و در نتیجه km /kcat 24% افزایش یافته است. به طور مشابه ای در حضور ایزوپروپانول و گلیسرول km /kcat آنزیم کایمر در قیاس با آنزیم وحشی افزایش یافته است. هر چند در مواردی همچون اتانول، dmf و متانول km /kcat آنزیم وحشی به اندازه 44، 40 و 4% به ترتیب بهبود یافته است.

آنژیوژنز در بسیاری از شرایط پاتولوژیک همچون رشد تومور، متاستاز، رتینوپاتی دیابتی، روماتوئید آرتریت و پسوریازیس نقشی کلیدی ایفا می کند. از میان تمامی فاکتورهای آنژیوژنیک، فاکتور رشد اندوتلیال رگی (vegf) مهمترین فاکتور آنژیوژنز محسوب می شود و فعالیت آن از طریق اتصال به دو گیرنده تیروزین کینازی به نام های گیرنده flt-1 (vegfr-1) و گیرنده kdr (vegfr-2) انجام می شود. هومودایمر vegf از طریق اتصال به vegfr-2 و القاء دایمریزاسیون آن باعث اتوفسفریلاسیون و فعال سازی مسیرهای انتقال سیگنال آنژیوزنز می شود. vegf به دلیل نقش اساسی اش در آنژیوژنز پاتولوژیک، به عنوان یک هدف دارویی ارزشمند برای درمان های ضدآنژیوژنز مطرح می باشد. یک واریانت هترودایمر از vegf (hd-vegf) که جایگاه اتصال به گیرنده آن در یک قطب دایمر دست نخورده و در قطب دیگر بلاک شده باشد تنها قادر خواهد بود به مونومر گیرنده متصل شود و در نتیجه قادر به القاء دایمریزاسیون گیرنده و انتقال سیگنال نخواهد بود. بنابراین hd-vegf می تواند به عنوان آنتاگونیست vegf عمل کرده و فعالیت وابسته به گیرنده vegf، که برای فرایندهای آنژیوژنز ضروری می باشد را متوقف نماید. با چنین فرضی، در این تحقیق جایگاه های اتصال vegf به kdr براساس ساختار کریستالی کمپلکس vegf-kdr بطور دقیق مشخص و با قطعات مناسب از سایر پروتئین ها در ساختار کریستالی مربوطه جایگزین شدند. پس از ساخت مدل سه بعدی جهش یافته و بهینه سازی آن توسط شبیه سازی دینامیک ملکولی، اتصال آن به گیرنده با استفاده از docking molecular مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بیانگر نامناسب بودن انرژی میانکنش این کمپلکس پروتئینی و در نتیجه عدم اتصال vegf موتانت به گیرنده می باشد. براساس مدل ساخته شده، ژن کد کننده دمین اتصال به گیرنده vegf که حاوی قطعات جایگزین فوق بود سنتز شد. قطعه کد کننده دمین اتصال به گیرنده vegf طبیعی در pet-28a+ دارای his tag و قطعه کد کننده دمین اتصال به گیرنده ژن vegf جهش یافته در وکتور بیانی pet-21a+ دارای strep tag درج و در باکتری e. coliبه صورت inclusion bodies بیان و پس از مخلوط نمودن رسوب با نسبت های برابر جهت تولید واریانت هترودایمر vegf، طی فرایند چند مرحله ای refold گردیدند. بدلیل وجود دو tag متفاوت، جداسازی هترودایمر vegf از همودایمرهای طبیعی و جهش یافته با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی دو مرحله ای و توسط ستون هایni-nta agarose و strep-tactin صورت پذیرفت. دایمر شدن واریانت های مختلف vegf که لازمه فعالیت این پروتئین می باشد از طریق sds-page و روش المان تایید گردید. مطالعات اسپکتروسکپی cd و فلورسانس تغییرات ساختاری محسوسی را در hd-vegf در مقایسه با هومودایمر طبیعی و جهش یافته نشان نداد ونیز شکل گیری صحیح فرم هترودایمر و همچنین صحت فرایند تخلیص را تائید نمود. توان ضدآنژیوژنز واریانت hd-vegf نیز بررسی گردید. نتایج نشان داد که این واریانت در غلظت های پائین به طور قابل توجهی قادر به مهار تکثیر و تشکیل لوله های مویرگی سلول های اندوتلیال می باشد (با ng/ml 24 و 33 ic50= به ترتیب برای تکثیر سلول-های اندوتلیال و تشکیل لوله های مویرگی). براساس این مطالعات می توان نتیجه گرفت که hd-vegf در اتصال به گیرنده با vegf طبیعی قادر به رقابت بوده و مانع از فعالیت آن در شرایط in vitro می گردد. ضمنا این واریانت در مقایسه با سایر آنتاگونیست های ضدآنژیوژنزvegf که تاکنون ساخته شده اند قدرت مهاری بسیار بالاتری دارد.

فتوپروتئینها گروهی از پروتئین های بیولومینسانس می باشند که دارای اهمیت و کاربردهای فراوانی در علوم مختلف هستند. از این رو تحقیقات گسترده ای برای درک مکانیسم این پروتئینها جهت بهینه کردن فعالیت آنها در حال انجام است. در این تحقیق، جهت شناخت بیشتر عملکرد فتوپروتئین نمیوپسین دو جهش leu36his و phe186his انتخاب شدند. از این گروه می توان به کلنترات، کتنفور و شعاعیان اشاره کرد که دارای تشابهات ساختاری بوده و به گروه فتوپروتئین های وابسته به کلسیم تعلق دارند. در این تحقیق برای بررسی مکانیسم نورزایی فتوپروتئین نمیوپسین جهش های leu36his و trp86his طراحی شد. نتایج نشان دادند که این جهش ها باعث از دست رفتن فعالیت می شود. نتایج cd و مطالعات فلورسانس نشان داد که موتانت های نمیوپسین دارای ساختار فشرده بیشتر و مارپیچ های آلفای کمتری در مقایسه با پروتئین طبیعی می باشد. شبیه سازی دینامیک مولکولی برای نمیوپسین های طبیعی و جهش یافته انجام شد و نتایج حاصل با داده های به دست آمده از شبیه سازی اکورین های طبیعی و موتانت phe149ser مقایسه شد. میزان rmsd و جابجایی در موتانت phe186his بیشتر از موتانت leu36his می باشد. از طرف دیگر، برای نشان دادن الگوی تحرک ساختاری پروتئین های موتانت و طبیعی میزان نوسانات ریشه میانگین مربعات (rmsf) برای هر ریشه محاسبه شد. نتیج نشان داد که ریشه های 1-13، 56-72، 77-96 و 137-141 از موتانت phe186his دارای بیشترین انعطاف پذیری بوده که اثر گلوبال این جهش را نشان می دهد، در حالی که اثر جهش leu36his بر ساختار به صورت موضعی می باشد. بعلاوه، نتایج نشان می دهد که تغییرات ساختاری در ناحیه گروه پراکسید موجود در پاکت اتصالی که نقش مهمی در فرآیند بیولومینسانس ایفا می کند، ممکن است باعث جلوگیری از تخریب گروه پراکسیدی شده و مانع از فرآیند بیولومینسانسی می شود. این نتایج می توانند در درک مکانیسم نورزایی در فتوپروتئین نمیوپسین استفاده شود.

ژن fry1 در گیاه آرابیدوپسیس یک ژن واکنشگر به تنش های غیر زیستی است که آنزیمی با دو کارکرد 3 (2) 5- بیس فسفات نوکلئوتیدازی و اینوزیتول پلی فسفات 1-فسفاتازی را کد می کند. فعالیت اینوزیتول پلی فسفات 1-فسفاتازی پروتئین fry1 نشان می دهد که این پروتئین به عنوان عامل کاتابولیسم اینوزیتول 1، 4، 5، تری فسفات (ip3) در مسیر پیام رسانی فسفواینوزیتید نقش دارد. نقش دیگر fry1، تجزیه ی فسفوآدنوزین 3، 5- بیس فسفات ((pap است که در سرکوب خاموشی پس از رونویسی ژن دخالت دارد. جهش نقطه ایold101 در اگزون شماره ? ژن fry1 باعث جایگزینی نوکلئوتید g با نوکلئوتید aشده است. این جهش در پروتئین کد شده توسط ژنfry1 سبب جایگزینی اسیدآمینه آسپارتیک اسید (asp38) با اسیدآمینه آسپاراژین(asn38) شده است [shirzadian-khoramabad et al., 2008]. به منظور بررسی نقش جهش old101 در ساختار این پروتئین، مدل سازی مولکولی پروتئین های fry1 و old101 بر اساس همولوگ مخمری این پروتئین (hal2) انجام شد. آنالیز مدل مولکولی old101 نشان داد که جهش old101 در ناحیه ای سنجاق سری موسوم به flap شامل رزیدوهای 31 تا 42 (در hal2 رزیدوهای 34 تا 45) اتفاق افتاده است که مثل یک درپوش روی جایگاه فعال را می پوشاند. با مطالعه ی پیوندهای هیدروژنی، پل های نمکی و سطح در دسترس این ناحیه، این فرضیه مطرح شد که این تغییر ساختار در ناحیه ی سنجاق سری پروتئین old101، در دسترسی سوبستراهای این آنزیم به جایگاه فعال نقش داشته باشد و منجر به کاهش فعالیت این آنزیم شود. به منظور بررسی فعالیت آنزیمی پروتئین های fry1 و old101 در شرایط in vitro، نسخه های cdna ژن های fry1 و old101 ابتدا در وکتور ptg19-t و سپس در وکتور بیانی pet28a کلون شدند. بیان پروتئین های نوترکیب old101 و fry1 در سلول های e.coli سویه ی bl21(de3) انجام گرفت و با sds-page تایید شد. پس از انجام تاخوردگی مجدد این پروتئین ها در شرایط in vitro و خالص سازی آن ها، فعالیت آنزیمی شان در حضور ip3 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از بررسی فعالیت آنزیمی این پروتئین ها و فعال بودن هر دو پروتئین در تجزیه ی سوبسترای ip3 حاکی از تاخوردگی صحیح آن ها و انجام موفقیت آمیز پروسه ی تاخوردگی این پروتئین ها در شرایط in vitro بود. نتایج فوق حاکی از کاهش 5/2 برابری فعالیت آنزیمی پروتئین موتانت old101 در مقایسه با پروتئین fry1 بود.

تاکنون هشت نوع فتوپروتئین وابسته به کلسیم گزارش شده است که بیشترین بررسی ها روی فتوپروتئین های کلنترات ها مثل اکورین و ابلین انجام شده است.امااطلاعات زیادی در مورد مکانیسم عمل فتوپروتئین نمیوپسین از گونه ی نمیوپسیس لیدی از خانواده ی کتنوفورهاو حفره ی اتصالی آن به کلنترازین وجو ندارد. در این تحقیق جهش های his 39arg و phe 131tyr با در نظر گرفتن اهمیت میان کنش ها در اطراف حلقه های مهم کلنترازین و حضور این آمینواسیدها در جایگاه اتصالی کلنترازین انجام شد. جهش ها هیچگونه فعالیتی را از خود نشان ندادند. اسپکتروسکوپی دو رنگ نمایی دورانی و فلورسانس نشان داد که تغییرات ساختاری در دو موتانت نسبت به فرم طبیعی محسوس است. نتایج حاصل از مطالعات خاموشی فلورسانس در حضور اکریل آمید و دینامیک مولکولی نشان داد که موتانت ها نسبت به نمیوپسین طبیعی دارای کانفورماسیون بسته تری هستند. به عبارت دیگر انعطاف پذیری ساختار نمیوپسین طبیعی نسبت به دو موتانت بیشتر است. تغییرات ساختاری و به دنبال آن عدم فعالیت دو موتانت دلیلی بر کلیدی بودن این آمینواسیدها در مکانیسم عمل و حضور آنها در جایگاه فعال نمیوپسین می باشد.

این پژوهش به منظور بررسی اثر نانو ذرات نقره و تیدیازرون در شرایط تاریکی در ارقام مختلف شمعدانی با حفظ کیفیت مطلوب انجام شد. در این مطالعه چهار آزمایش طراحی گردید. آزمایش اول به منظور بررسی حساسیت ارقام مختلف گل های شمعدانی نسبت به سطوح تاریکی و اتفن اجرا شد. نتایج نشان داد که ارقام فاکسی و آنتونی کمترین حساسیت و بلوواندر و فلاورفیری بیشترین حساسیت را نسبت به سطوح تاریکی و اتفن از خود بروز دادند. بطوریکه رنگیزه های فتوسنتزی و ریزش گلبرگ دستخوش تغییرات زیادی در ارقام حساس گردید. آزمایش دوم به منظور بررسی اثر تیمارهای نانوذرات نقره در سطوح (0-20-40-60-80 میلی گرم در لیتر) و تیدیازرون در سطوح (0-25-50-75-100 میکرومولار) بر کیفیت ظاهری و فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی در طی شرایط تاریکی انجام شد. نتایج آزمایش نشان داد که سطح 60 میلی گرم در لیتر نانوذرات نقره و سطح 75 میکرومولار تیدیازرون بیشترین تاثیر را بر صفات مورفولوژیک (درصد ریزش گلبرگ، سبزینگی برگ) و صفات فیزیولوژیک (رنگیزه های فتوسنتزی، فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی، پایداری غشاء، محتوای پروتئین، پراکسیداسیون لیپید، فعالیت آیزوزایم ها) گذاشت و از این طریق با تاخیر در پیری برگ، ماندگاری آن را نیز افزایش داد. آزمایش سوم به منظور بررسی اثر ترکیبی تیمارهای آزمایش در بهترین سطوح تاثیر گذاری (60 میلی گرم نانوذرات نقره و 75 میکرومولار تیدیازرون) در شرایط تاریکی و نیز تنش اتفن (در سطح 60 میلی گرم در لیتر) اجرا گردید. نتایج آزمایش در شرایط تاریکی نشان داد که تیمار ترکیبی بیشترین تاثیر مثبت را در تمامی صفات اندازه گیری شده اعم از مورفولوژیک و فیزیولوژیک در تمامی ارقام نسبت به شاهد داشت. اما در شرایط تنش اتفن، با وجود خسارت فراوان در ارقام حساس (بلوواندر و فلاورفیری)، تیمار ترکیبی باعث کاهش شدت خسارت در این ارقام شد. آزمایش چهارم به منظور بررسی اثر تیمارهای نانوذرات نقره (0-20-40 میلی گرم در لیتر) و تیدیازرون (0-50-100 میکرومولار) بر عملکرد متابولیت های ثانویه شمعدانی معطر اجرا گردید. اسانس گیری با استفاده از دستگاه کلونجر و شناسایی ترکیبات با استفاده از دستگاه gc و gc/ms انجام شد. نتایج آزمایش نشان داد که اثر تیمارها بر صفات مورفولوژیک، درصد اسانس، عملکرد اسانس و ترکیبات آن تفاوت قابل ملاحظه ای داشت. بطوریکه تیمارهای نانوذرات نقره و تیدیازرون در بعضی سطوح n20t0 هر چند درصد اسانس را افزایش داد اما عملکرد اسانس تحت این شرایط کاهش یافت. در واقع بر آیند بین مقدار درصد اسانس و عملکرد آن دو مولفه مهم و تعیین کننده تولید اسانس در گیاهان دارویی می باشد. بطورکلی در این مطالعه، 26 ترکیب در اسانس گیاه شناسایی گردید. ترکیب عمده اسانس در تمام تیمارها citronellol بود که تقریباً نصف ترکیبات موجود در اسانس را به خود اختصاص داد و تغییرات آن در تیمارهای مختلف بین 1/46 درصد در تیمار n40t100 تا 4/51 درصد در تیمار n20t50 بوده است.

امروزه استفاده از فتوپروتئین ها به واسطه سیگنال کم پس زمینه ای جایگاهی ویژه یافته است. در بین فتوپروتئین های رایج، اکثر مطالعات روی فتوپروتئین اکورین متمرکز شده است. در سال های اخیر محققین شرکت axxam سه فتوپروتئین ارتقاء یافته به نام های photina، i-photina و c-photina تولید کردند. این فتوپروتئین ها به واسطه سیگنال دهی قوی و نیز بادوام تر خود نسبت به اکورین، دریچه ی نوینی را به روی کاربرد بیولومینسانس در سنجش های hts گشوده اند و درحال حاضر فرم تجاری این سه فتوپروتئین توسط شرکت های مختلفی عرضه می گردد. در این تحقیق فتوپروتئین i-photina به دلیل شدت سیگنال بالاتر و همچنین پایداری نسبتاً مناسب آن نسبت به دو فتوپروتئین دیگر جهت مطالعه و نیز تولید واریانت هایی از آن با خصوصیات بهبود یافته از جمله تغییر در طول موج نشری انتخاب گردید. این مهم تا حدودی با ایجاد موتانت هایی از i-photina (f91y و w95f) محقق شد. ابتدا ترجیح کدونی ژن i-photina براساس سلول های پستانداران و e. coli تنظیم گردید. سپس توالی مربوطه سنتز و در باکتری e. coli بیان شد. در مرحله بعد جهش زایی به روش quikchange انجام شد. در نهایت خصوصیات بیولومینسانسی فتوپروتئین های اکورین، i-photina و جهش یافته ها و نیز ساختار آن ها با روش های مختلف تجربی و تئوری مورد مطالعه و مقایسه قرار گرفت. شدت سیگنال i-photina نسبت به اکورین نزدیک به 14 برابر به دست آمد. تغییر خصوصیات بیولومینسانسی در جهش یافته های f91y و w95f به ترتیب شامل 20 و 10 نانومتر جابه جایی طیف نشری به سمت طول موج های کوتاه تر، 30% افزایش و 80% کاهش در شدت سیگنال نشری و نیز افزایش میزان حساسیت به کلسیم و مدت زمان نوردهی در هر دو جهش یافته نسبت به i-photina بود. با توجه به بهبود بسیاری از خصوصیات بیولومینسانسی جهش یافته f91y، می توان آن را به عنوان یک گزارشگر بیولومینسانسی بسیار کارآمد در سنجش های hts و نیز سنجش های همزمان نسبت به سایر فتوپروتئین های رایج از جمله اکورین و نیز i-photina مطرح نمود.

گلوتاتیون اس- ترانسفراز ها(gsts, ec 2.5.1.18) نقش مهمی را در سم زدایی فاز دوم ترکیبات خارجی (دارو ها، حشره کش ها و علف کش ها) و ترکیبات درونی اکثر موجودات زنده بازی می کنند. در این مطالعه آنزیم gst از دو جمعیت پسیل پسته حساس و مقاوم به فوزالون با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی سفارز b4 خالص سازی شد و خصوصیات بیو شیمیایی آنزیم خالص شده با استفاده از سوبسترا های مصنوعی مثل 1-کلرو 2 و 4- دی نیتروبنزن (cdnb) و گلوتاتیون احیا شده (gsh) اندازه گیری شد. ابتدا جهت اثبات مقاومت، آزمون های زیست سنجی به روش تماس با باقیمانده سم در لوله آزمایش rcv)) با استفاده از ماده ی تکنیکال فوزالون انجام شد. نتایج زیست سنجی نشان داد میزان lc50 ی فوزالون روی جمعیت رفسنجان و بم به ترتیب 145 و 667/935 میلی گرم بر میلی لیتر بود. میزان مقاومت در جمعیت بم 4/6 برابر جمعیت حساس به دست آمد. اندازه گیری فعالیت آنزیم گلوتاتیون اس -ترانسفراز در دو جمعیت تابستان و زمستان گذران نشان دهنده فعالیت بالا تر این آنزیم در جمعیت تابستان گذران بود. به طوری که میزان فعالیت ویژه این آنزیم در جمعیت تابستان گذران بم 46/1 برابر فعالیت این آنزیم در جمعیت زمستان گذران آن بود. هم چنین میزان فعالیت ویژه این آنزیم در جمعیت زمستان گذران بم 54/2 برابر فعالیت آن در جمعیت زمستان-گذران رفسنجان می باشد. در این تحقیق آنزیم گلوتاتیون اس- ترانسفراز با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی از دو جمعیت رفسنجان و بم خالص و ویژگی های بیو شیمیایی آن ها مورد مقایسه قرار گرفت. فعالیت ویژه آنزیم خالص شده در دو جمعیت حساس و مقاوم به ترتیب 26/10 و 04/13 میکرومول بر دقیقه بر میلی گرم پروتئین بود. آنالیز های سینتیکی نشان داد هنگامی که از غلظت های مختلف cdnb و غلظت ثابت gsh استفاده شد، آنزیم خالص شده در جمعیت مقاوم، km و vmaxبالا تری نسبت به جمعیت حساس دارد. ph و دمای بهینه برای فعالیت آنزیم گلوتاتیون اس- ترانسفراز در هر دو جمعیت حساس و مقاوم به ترتیب 7 و 30 درجه سلسیوس به دست آمد. آنزیم gst خالص شده روی sds-page یک باند با وزن ملکولی 21 کیلودالتون نشان داد. آنزیم gst در هر دو جمعیت به طور کامل توسط zncl2 و sds و تاحدودی توسط اوره، kcl، mncl2، mgcl2 و hg2cl2 مهار می شود. آزمون های بازدارندگی با حشره کش های رایج در کنترل پسیل پسته (آمیتراز، ایمیداکلوپرید، استامی پرید و فوزالون) نشان داد که این ترکیبات اثرات بازدارندگی روی gst هر دو جمعیت دارند. نتایج این مطالعه اطلاعات پایه ای در مورد gst پسیل پسته فراهم نموده و مطالعات بیشتر در فهم مکانیسم های مقاومت پسیل پسته به آفت کش ها، کمک خواهد کرد.

یکی از دلایل عمده¬¬ی مقاومت فوق¬العاده¬ بالای سیست آرتمیا به استرس در شرایط چالش بر¬انگیزی نظیر خشکی شدید، بی¬آبی، فقدان اکسیژن طولانی مدت، درجه حرارت¬های بالا و دوزهای بالای پرتو فرابنفش، سنتز منظم پروتئین آرتمین (یکی از اعضای فراخانواده¬ی فریتین) است. پیش از این، cdna¬ی آرتمین از جنین¬ سیت آرتمیا اورمیانای دریاچه¬ی¬ ارومیه جداسازی و درون وکتور pet28a به¬ منظور تولید سلول¬های e. coli نوترکیب کلون و بیان شد، و مشخص شد که می¬تواند به ¬عنوان یک چپرون کارآمد در شرایط in vitro عمل کند. به¬علاوه، نشان داده شد که بیان آرتمین در e. coli مقاومتی دمایی را به این سلول¬ها اعطا کرده و حیات سلول¬ها در برابر دماهای کشنده را بهبود می¬بخشد که احتمالا به ویژگی ضد تجمعی آن در شرایط in vivo باز می¬گردد. هرچند که اطلاعات کمی در مورد عملکرد آرتمین در سلول¬های زنده در دسترس می¬باشد. در این مطالعه، با توجه به نقش ضداسترسی پروتئین آرتمین، اثر محافظتی قابل توجه آرتمین تحت شرایط استرسی مختلف در شرایط in vivo بررسی شد. همچنین به¬منظور بررسی مستقیم فعالیت چپرونی، از ژن گزارشگر لوسیفراز به¬عنوان سوبسترای مدل استفاده شد. سیستم بیان همزمان لوسیفراز و آرتمین معرفی شده در این مطالعه، می¬تواند به¬عنوان یک سیستم گزارشگر real time جهت بررسی فعالیت چپرونی پروتئین¬ها در شرایط in vivo به¬کار گرفته شود و یک سنجش ساده و سریع برای چپرون¬های مولکولی را فراهم کند. از این¬رو، کوترنسفرماسیون سلول¬های e. coli سویه¬ی bl21 (de3) با دو وکتور بیانی حاوی ژن¬های آرتمین و لوسیفراز انجام شد. جهت بررسی فعالیت چپرونی در شرایط in vivo، ابتدا اثر آرتمین بر میزان بقا/رشد سلول¬¬ در برابر استرس های مختلف تعیین شد. باکتری¬های ترانسفورم شده¬ی حاوی ژن آرتمین تحت تیمارهای مختلف استرس قرار گرفتند و تاثیر بیان این پروتئین بر مقاومت باکتری به استرس بررسی شد. نتایج نشان داد که سلول¬های بیان کننده¬ی موقت آرتمین، مقاومت بسیار بالایی را به استرس¬های مختلف اعمال شده نشان دادند. بنابراین، با توجه به نتایج بدست آمده می¬توان حدس زد که آرتمین به ¬طور قابل توجهی، بقای سلول¬های باکتری ترانسفرم شده¬ی تحت استرس¬های گرما، اکسیداتیو، شوری، سرما و پرتو uv را افزایش می¬دهد. ازطرفی، قابلیت آرتمین بر محافظت لوسیفراز علیه غیرفعال سازی استرسی سنجیده شد. سلول¬های کوترانسفرم شده در معرض استرس¬های مختلف قرار گرفتند. فعالیت لوسیفرازی نمونه¬ها به¬عنوان گزارشی از وضعیت درون سلولی تحت این شرایط آشکار گردید. براساس نتایج بدس آمده، فعالیت لوسیفرازی باقیمانده در سلول¬های تحت القای آرتمین، به¬طور قابل توجهی بالاتر از نمونه¬های¬ فاقد آرتمین (کنترل) بود. جالب¬تر این¬که، این عملکرد به منظور بازیابی فعالیت لوسیفرازی در شرایط in vivo ضروری است، چرا که لوسیفراز به¬ تنهایی قادر به بازیابی فعالیت از دست رفته¬ی خود به¬طور کار¬آمد نیست. این¬طور به ¬نظر می¬رسد که در شرایط in vivo، آرتمین از طیف وسیعی از سوبستراها محافظت می¬کند و به ¬طور انتخابی توالی¬های پپتیدی را شناسایی کرده و به آن¬ها متصل می¬شود. حدس ما بر این است که: آرتمین علاوه بر لوسیفراز، از سایر پروتئین¬های درون سلولی حساس به شرایط استرس نیز محافظت می¬کند. روی هم رفته، با این نتایج می¬توان حدس زد که آرتمین در شرایط استرس، متحمل برخی تغییرات کانفورماسیونی وابسته می¬شود که در نهایت تغییر هیدروفوبیسیته¬ی سطحی آن را به دنبال دارد. این تغییرات جهت اتصال آرتمین به سوبستراهای پروتئینی و عملکرد آن ضروری است.

آنزیم متیل گلی اکسال سنتاز ترموفیل اولین بار ازگونه ی باکتریای thermus sp.gh5 (tmgs) جدا سازی و تعیین ساختار شد. این آنزیم به طور اختصاصی تبدیل دی هیدروکسی استن فسفات به متیل گلی اکسال و ارتوفسفات را کاتالیز میکند و مسیر گلیکولیز را از جهت اصلی خود منحرف میسازد. tmgsبه صورت هموهگزامر بوده و فسفات مهار کننده ی قوی و افکتور آلوستریک منفی آن است. پس از اتصال فسفات به جایگاه افکتور، دو نوع از تغیرات ساختاری در آنزیم مشاهده میشود. تغییرات ساختاری عمده در اطراف جایگاه فعال آنزیم منجر به بسته شدن کانال ورودی سوبسترا به سمت جایگاه فعال میشود و سبب تغییر کنفورماسیون آنزیم از شکل باز(عدم حضور فسفات) به شکل بسته (در حضور فسفات) میشود. همچنین تغییرات ثانویه ایجاد شده در الگوی میانکنش های بین زیرواحد ها منجربه انتقال پیام آلوستری در آنزیم میشود. با اتصال فسفات به آنزیم میانکنش جدیدی بین باقیمانده های آسپارتات 100 و آرژنین 80 ایجاد میشود که امکان دخیل بودن آنها در مسیر انتقال اطلاعات آلوستری در حضور مهار کننده وجود دارد. جهت بررسی این فرضیه باقیمانده های آسپارتات 100و آرژنین 80 بوسیله جهش زایی هدف دار تغییر داده شد و خصوصیات سینتیکی، رفتار آلوستری، تغییرات ساختاری و میزان پایداری این آنزیم اولیگومر جهش یافته مورد بررسی قرار گرفت. بررسی آنزیم های جهش یافته نشان داد که در اثر تخریب پل نمکی بین اسید آمینه های آسپارتات 100 و آرژنین 80 خصوصیت آلوستریکی در آنزیم به شدت کاهش پیدا می کند که این موضوع میتواند نقش این اسید های آمینه در انتقال پیام میان زیرواحدهای آنزیمی را آشکار کند.

مالتوژنیک آمیلازها گروهی از آنزیم¬های هیدرولیز کننده سیکلودکسترین¬ها و متعلق به خانواده آلفا-آمیلاز (خانواده 13 گلیکوزیدهیدرولاز) می¬باشند. این آنزیم در محلول به صورت همودایمر با دو جایگاه فعال است. هر جایگاه فعال از همکاری دمین a و c یک زیرواحد با دمین n زیرواحد دیگر تشکیل می¬گردد که توانایی هیدرولیز سوبستراهای مختلف از جمله نشاسته، پلولان و سیکلودکسترین¬ها را دارند. با تشکیل همودایمر، جایگاه فعال عمیق و باریکی تشکیل می شود که سوبستراهای مسطح cd نسبت به سوبستراهای پلی¬مری نشاسته یا پلولان ترجیح داده می¬شود. مالتوژنیک آمیلازها از نظر کاربردی و تحقیقاتی بسیار با اهمیت هستند و اخیرا توجه به استفاده از این آنزیم¬ها در صنعت بخصوص در صنایع نانوایی، شیرینی¬پزی و همچنین پزشکی و نیز طراحی داروها چشمگیر بوده است. تاکنون در مورد دست¬ورزی توالی و ارتباط بین دمین¬های آنزیم مالتوژنیک آمیلاز سویه بومی geobacillus sp.gh6 گزارشی ارائه نشده است. هدف از این تحقیق آن است که با طراحی لینکر اختصاصی در بین دمین¬های آنزیم، تغییری در خصوصیات ساختاری، بیوشیمیایی و بیوفیزیکی این آنزیم بومی داده شود. لینکر مذکور به گونه¬ای بین دمین n و دو دمین دیگر همان زنجیره درج گردید که امکان تشکیل و بازسازی جایگاه فعال توسط یک زنجیره منفرد فراهم گردد.. با استفاده از تکنیک¬های مدل¬سازی و شبیه¬سازی، لینکر اختصاصی مناسب برای اتصال دمین¬های آنزیم انتخاب شد و ژن کدکننده آن تهیه گردید. این ژن درe. coli بیان شد و سپس تخلیص گردید. با وارد کردن این لینکر به توالی آنزیم، دمای بهینه آنزیم از °c 65 به °c 45 تغییر کرد، با این حال آنزیم طراحی¬شده نیز همچون آنزیم طبیعی پس از گذشت یک ساعت در °c 60 ،80% فعالیت خود را حفظ می¬کند. هر دو آنزیم در محدوده وسیعی از ph فعال هستند، اما ph بهینه آنزیم تغییر یافته از 5/5-6 به 5/7-8 ارتقا یافته است. هر دو آنزیم، سیکلودکسترین¬ها را به سوبستراهای پلی¬مری ترجیح می¬دهند و تمایل به -α بیشتر از -β و بیشتر از -cd است. این در حالی است که تمایل آنزیم جهش¬یافته نسبت به آنزیم طبیعی به سوبستراهای پلیمری بسیار افزایش یافته است. آنزیم جهش¬یافته فعالیت آلوستریکی در دمای °c 52 و 7 ph= از خود نشان نمی¬دهد؛ این در حالی است که بین دو زیر واحد آنزیم طبیعی در فرم دایمر فعالیتی با تعاونی مثبت دیده می¬شود. این نتایج و نتایج حاصل از کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی نشان دهنده احتمال تشکیل مونومر فعال از این آنزیم است.

لاکازها (1.10.3.2 ;ec پارادی فنولدی اکسیژن اکسیدوردوکتاز) بدلیل قابلیت اکسیداسیون طیف گسترده ای از ترکیبات فنولی کاربردهای زیادی در صنایع بیوتکنولوژی دارند. لاکازهاآنزیمهای چند مسی متعلق به گروه اکسیدازهای آبی هستند کهدی فنول ها و مواد وابسته را اکسیدکرده و اکسیژن مولکولی را به عنوان پذیرنده نهایی الکترون استفاده می کنند.در این پژوهش ژن کد کننده لاکاز از باکتری b.pumilus سویه gaz23بوسیله پرایمرهای کلونینگ تکثیر و سپس در ناقل بیانی (pet28a)کلون و به باکتریe.coliسویه bl21 انتقال یافت و آنالیز توالی انجام گرفت. ژن لاکاز حاوی 1533 نوکلئوتید بوده و 510 اسید آمینه را کد می کند.ژن لاکاز جدا شده از سویه gaz23 دارای 67% شباهت آمینو اسیدی به پروتئینcotaاز باسیلوس سوبتیلیس و 95% شباهت به لاکاز باسیلوس پامیلوس سویه safr-032 می باشد.بمنظور بدست آوردن مقادیر بالای پروتئین محلول ، بیان تحت شرایط آئروبیک و در دمای پایین انجام گرفت. پروتئین نوترکیب بوسیله ستون تمایلی تخلیص و وزن مولکولی آنزیم بوسیلهsds-page،68 کیلو دالتون تعیین گردید. خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم با استفاده از دو سوبسترای معمول لاکاز2, 2’-azino-bis(3-ethylbenzothioazolin-6-sulphonic acid) (abts) وsyringaldazine (sgz)انجام گرفت.

آنزیم بازیافت کننده لوسیفرین (lre) در بازیافت d-luciferin به صورت in vitro مشارکت می نماید و سبب افزایش شدت و زمان نشر نور لوسیفراز حشره می شود. دُمین های اتصالی به لوسیفرین i و ii به عنوان نواحی بالقوه جایگاه اتصالی لوسیفرین شناخته شده اند. در این تحقیق برای نخستین بار آمینواسیدهای t69، g75 و k77 موجود در دُمین اتصالی به لوسیفرین i مربوط به t-lre از گونه l.turkestanicus از طریق جهش زایی هدفمند جایگزین گردیدند. در مقایسه با دیگر جهش یافته ها، t69r بازه زمانی نشر نور را طولانی تر می نماید و همچنین سبب افزایش 2 برابری شدت نور می شود. افزون بر این، جهش یافته k77e/t69r نشر نور لوسیفراز را به میزان دو برابر ولی به صورت کوتاه مدت افزایش داد. برعکس، جهش یافته های g75e، k77e و g75e/t69r نتوانستند نشر نور لوسیفراز را در in vitro افزایش دهند و جهش یافته های k77e/g75e و k77e/g75e/t69r رفتار حد واسط داشتند. به علاوه، نتایج مطالعه مشخص نمود که در غیاب t-lre (t69r)، غلظت های 5 میلی مولار از d و l-cysteine سبب افزایش معنادار در نشر و زمان نشر نور لوسیفراز شده و decay rate نشر لوسیفراز را کاهش می دهند. بر مبنای مطالعات فعالیت، آنالیز far-uv cd، نتایج فلورسانس ans و dls آنزیم لوسیفراز در حضور و عدم حضور d-cysteine، آمینواسید d-cysteine مستقیما لوسیفراز را تحت تأثیر قرار می دهد زیرا پتانسیل redox ضعیف داشته، دارای خاصیت ضد تجمعی (anti-aggregatory) است و کنفورماسیون و ویژگی های سینتیکی لوسیفراز را تغییر می دهد. در یک جمع بندی کلی می توان گفت که احتمالاً آمینواسیدهای جهش یافته در جایگاه فعال آنزیم t-lre قرار دارند، به نظر می رسد که در جهش یافته t69r اسیدآمینه arg69 جایگزین شده که معادل arg218 لوسیفراز می باشد، اتصال به آکسی لوسیفرین را بهبود می بخشد و حضور آمینواسیدهای gly75 و نیزk77 جهت عملکرد مطلوب آنزیم چندکاره t-lre ضروری می باشد. به علاوه، بر مبنای این پژوهش می توان گفت که بخش اعظم افزایش در میزان و زمان نشر نور در واکنش های جفت شده lre و لوسیفراز در مطالعات قبلی از تأثیر مستقیم d-cysteine بر ساختار و فعالیت لوسیفراز حاصل شده است.

فتوپروتئین های وابسته به کلسیم یکی از اعضای خانواده ی ef-handپروتئین های متصل شونده به کلسیم می باشند. با اضافه شدن کلسیم یک واکنش دکربوکسیلاسیون در پروتئین رخ می دهد که در طی این واکنش کلنترازین متصل به پروتئین به کلنترامید تبدیل شده و نشر بیولومینسانس از پروتئین ساطع می شود. چنانچه از هومولوژی توالی اولیه آن ها انتظار می رود همه ی فتوپروتئین ها ساختار کروی شکل متراکمی دارند. ساختار سوم آن ها شامل دو جفت از چهار مارپیچ است که موتیف helix-turn-helix (hth) را تشکیل می دهند. مارپیچ اول و دوم در انتهای آمینی و مارپیچ سوم و چهارم در انتهای کربوکسیلی قرار دارند. گروه peroxy-coelentrazine به پاکتی بسیار هیدروفوب در ساختار پروتئین متصل می شود که این پاکت به وسیله ی باقیمانده های آمینواسیدی هیدروفوب متعلق به مارپیچ ایجاد می شود. نمیوپسین و اکورین دو فتوپروتئین با اهمیت، به ترتیب متعلق به دو خانواده ی کتنوفور و کلنترات می باشند. این دو گروه از فتوپروتئین های وابسته به کلسیم برخلاف تفاوت بالا در توالی-شان درجه بالایی از شباهت ساختاری نشان می دهند. بر روی فتوپروتئین نمیوپسین جهش های زیادی اعمال شده است اما اغلب آنها منجر به از بین رفتن کامل فعالیت نوری شده است. درتلاشی برای پی بردن به نقش ef-hand ها در واکنش بیولومینسانسی فتوپروتئین ها، فتوپروتئینی کایمر متشکل از اسید آمینه های 1 تا 118 از نمیوپسین (ef-handهای اول و دوم) و 109 و 199 از اکورین (ef-handهای سوم و چهارم) ساخته، بیان و سپس تخلیص گردید. این کایمر براساس نتایج مطالعات مدل سازی و مطالعات تئوری انتخاب شد. نتایج نشان داد که فتوپروتئین کایمر فعال بوده و دارای خصوصیات ساختاری و عملکردی متفاوتی از اکورین و نمیوپسین است. این خصوصیات از قبیل فعال شدن در برابر نور و دامنه ی ph بهینه ی وسیع در phهای اسیدی می باشد. نتایج مطالعات تئوری و تجربی نشان داد که به نظر می رسد موتیف های ef-hand در پروتئین کایمر در جهت تشکیل حفره ی اتصال به کلنترازین در موقعیت مناسبی قرار گرفته اند و ریز محیط مناسبی را برای شروع واکنش نوری ایجاد نموده اند. به-علاوه این مطالعات نشان داد فعالیت بیولومینسانسی فتوپروتئین ها به شدت مرتبط با تشکیل صحیح ریز محیط اطراف کروموفر می باشد، حتی اگر از موتیف های helix-turn-helix متعلق به دو خانواده مختلف که در توالی بسیار متفاوت هستند تشکیل شده باشد.

بتالاکتوگلوبولین بطور غالب از صفحه بتا تشکیل شده¬است اما دارای حدواسطی با ساختار مارپیچ آلفای غیرطبیعی است. مشخص شده است در طی سرشتگی بتالاکتوگلوبولین انتقالات ساختاری صفحه بتا به مارپیچ آلفا اتفاق می¬افتد. تحقیقات نشان دادند آرتمین بر مسیر سرشتگی بتالاکتوگلوبولین تاثیر می¬گذارد. جنین نهفته آرتمیا به¬طور شگفت انگیزی به استرس¬های محیطی شدید مقاوم است؛ این مقاومت به دلیل وجود پروتئینی به نام آرتمین است. در بخش اول مطالعه حاضر اثر آرتمین بر تجمع بتالاکتوگلوبولین مورد بررسی قرار گرفت. پیش از این آرتمین نوترکیب از جنین خفته آرتمیا ارومیانا در دریاچه ارومیه قبلا استخراج و ژن آن کلون شد. این پروتئین در e. coli بیان شده و سپس تخلیص شد. نتایج نشان دادند که آرتمین از تجمع بتالاکتوگلوبولین بصورت وابسته به غلظت جلوگیری می-کند. در حضور 5 و 15 ماکروگرم بر میلی¬لیتر آرتمین کدورت به میزان تقریبا 8 و 4 برابر کاهش یافت. در بخش دوم این مطالعه، اثرات 0، 10%، 20% و 30% تری¬فلوئورواتانول بر ساختار و تجمع بتالاکتوگلوبولین با روش¬های طیف-سنجی و ژل الکتروفورز بررسی شد. نتایج نشان داد که تری¬فلوئورواتانول باعث القای ساختار مارپیچ آلفا در بتالاکتوگلوبولین می¬شود. سوال اصلی که ما در این تحقیق سعی داریم به آن پاسخ دهیم این است که: اثر حالت¬های حدواسط بر تجمع پروتئین چیست؟ بدین منظور تجمع بتالاکتوگلوبولین طبیعی و حالت¬های حدواسط آن در ph ها، دماها و قدرت¬های یونی مختلف بافر و همچنین غلظت¬های مختلف پروتئین مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان دادند که سرعت تجمع بطور قابل توجهی در حضور تری¬فلوئورواتانول افزایش می¬یابد. همچنین، در حالت طبیعی و حالت¬های حدواسط سرعت تجمع با افزایش غلظت بتالاکتوگلوبولین افزایش می¬یابد. غلظت کلرید سدیم تا 60 میلی-مولار باعث افزایش سرعت تجمع و در غلظت¬های بالاتر باعث کاهش ناگهانی تجمع می¬شود. به منظور بررسی اثر ph، آزمایشات در ph های 2، 7/4، 7 و 8 انجام شد و نمونه¬ها در دمای 80 درجه سانتی¬گراد به مدت 20 دقیقه انکوبه شدند. نتایج نشان دادند که در عدم حضور تری¬فلوئورواتانول در ph ¬های 2، 7 و 8 کدورتی وجود ندارد، اما ژل الکتروفورز، تشکیل دایمر، تترامر و الیگومر را نشان داد. در 7/4 = ph، نمونه حتی قبل از قرار گرفتن در دمای 80 درجه سانتی¬گراد کدر بود. تری¬فلوئورواتانول باعث افزایش تجمع بتالاکتوگلوبولین در همه ph ها می¬شود. با استفاده از طیف¬سنجی دورنگ¬نمایی دورانی و فلورسانس ذاتی مشخص شد که با افزودن تری¬فلوئورواتانول انتقالات ساختاری صفحه بتا به مارپیچ آلفا و واسرشتگی ساختار سوم اتفاق می افتد. بنابراین چنین می¬توان نتیجه گرفت که حالت¬های حدواسط بتالاکتوگلوبولین بیشتر از حالت طبیعی¬ آن مستعد تجمع هستند.

بدلیل نقش کلیدی vegf در رگزایی پاتولوژیک، مهار آن از مهمترین استراتژی ها در درمان بیماری های مختلف بخصوص سرطان می باشد. در حال حاضر مؤثرترین دارو بر علیه vegf آنتی بادی های مونوکلونالی هستند که این مولکول را هدف قرار می دهند. آنتی بادی های معمول علیرغم نقش مهمی که در درمان سرطان ایفا می کنند دارای معایبی می باشند که آنتی بادی های تک دمینی یا vhh بعنوان کوچکترین قطعات آنتی بادی بر آنها فائق آمده اند. خصوصیات منحصر بفرد vhh ها موجب گردیده بر آنتی بادی های معمول برتری جسته و بعنوان جایگزینی مناسب برای آنها مطرح باشند. بعلاوه ویژگی های مطلوب فیزیکوشیمیایی و فارماکولوژیک vhh ها، آنها را در زمره نسل جدید داروهای از نوع آنتی بادی قرار داده است. با توجه به اهمیت مهار vegf و ویژگی های بی نظیر vhh ها، هدف از این مطالعه، تولید vhh علیه دمین متصل شونده به رسپتور vegf قرار داده شد، تا بدین ترتیب از اتصال vegf به رسپتورش ممانعت بعمل آید. بمنظور جداسازی vhh هایی که اختصاصا جایگاه عملکردی vegf را هدف قرار می دهند، بر اساس ساختار دقیق کمپکس vegf-rbd/vegfr2، از یک استراتژی غربال گری ترکیبی بر اساس تکنیک های نمایش فاژی و الایزای رقابتی استفاده گردید. پس از تهیه گنجینه ژنی قطعات vhh از شتر ایمن، کتابخانه نمایش فاژی vhh ساخته شد. برای جداسازی فاژهای نمایشگرvhh با تمایل بالا به دمین متصل شونده به رسپتور vegf، غنی سازی های متوالی سختگیرانه ای انجام گرفت. فاژهای اختصاصی علیه پروتئین هدف طی 6 دور غنی سازی بطور قابل توجهی غنی گردیدند. نتایج الایزای رقابتی حاکی از این بود که 82 درصد کلون های غربال شده، برای اتصال به مولکول vegf، با vegfr2رقابت کرده و به جایگاه اتصال به رسپتور vegf متصل می شدند. ساختار سه بعدی این vhh ها مدل¬سازی و توسط شبیه سازی دینامیک مولکولی بهینه شد. سپس با استفاده از شبیه سازی میانکنش بین مولکولی آنتی ژن-آنتی بادی بر اساس اطلاعات کریستالوگرافی کمپلکس vegf/vegfr2، شبیه سازی دینامیک مولکولی و محاسبات انرژی آزاد mm/pbsa، تصویری از جایگاه اتصال آنتی بادی ها بر روی آنتی ژن ارائه گردید. بر اساس نتایج مطالعات، vhh های منتخب با انرژی اتصال بالایی به جایگاه اتصال به رسپتور vegf متصل شدند و بیشترین تمایل را به آمینواسیدهایی از vegf نشان دادند که مسئول اتصال vegf به vegfr2 بودند. نتایج الایزای رقابتی، ایمونواسی با واریانت موتانت vegf و نیز مطالعات تئوری نشان داد آنتی بادی ها بطور مؤثری آمینواسیدهای کلیدی عملکردی vegf را پوشش داده، مانع اتصال vegf به رسپتور آن می گردند و احتمالا فعالیت بیولوژیک آن را مختل می سازند. این مطالعه، vhh های منتخب را بعنوان کاندید مناسب ضد vegf و ضد آنژیوژنز معرفی می کند.

آنزیم های dna ligase پایدار به حرارت به علت قابلیت های خود از اهمیت بالایی در زیست شناسی مولکولی برخوردارند. در این بین، آنزیم dna ligase از باکتری thermus thermophilus (tth dna ligase) با قابلیت های ویژه ی خود من جمله پایداری بالای حرارتی و دقت بالای عملکرد، می تواند کاربردهای وسیعی را در تکنیک های تشخیصی بیماری های ژنتیکی مانند تکنیک lcr (ligation chain reaction) و mlpa (multiple ligation-dependent probe amplification) داشته باشد.در این پروژه سعی در بیان، تخلیص و تعیین ویژگی آنزیم مذکور با هدف استفاده از آن در روش mlpa شده است. با توجه به هدف اصلی پژوهش، از آنزیم مذکور در کیت mlpa نیز استفاده شد که نتایج حاکی از فعالیت نسبی این آنزیم در کیت مذکور بود.

فتوپروتئینهای وابسته به یون کلسیم از دو خانواده کتنوفور (شانه داران) و کلنترات (کیسه تنان) با وجود تشابه ساختاری بالا، میزان تشابه آمینواسیدی بسیار پایینی دارند. در فتوپروتئینهای کلنترات، حفره اتصال به کلنترازین شدیداً آبگریز و دور از دسترس حلال است و اگرچه هیچ آمینواسید بارداری دیده نمیشود، حضور یک باقیمانده دارای بار مثبت، یعنی آرژنین 39 (در نمیوپسین)، در این حفره در فتوپروتئینهای کتنوفور بسیار جلب توجه میکند. جهش یافته r39k نمیوپسین نسبت به فرم طبیعی بیش از 9 برابر افزایش فعالیت نشان میدهد، به علاوه این جهش یافته افزایش توأم فعالیت و پایداری را به همراه داشته است. بنابراین، این موقعیت در کتنوفورها نه تنها تنظیم کننده فعالیت است، بلکه موقعیتی کلیدی در پایداری این فتوپروتئینها نیز محسوب میشود. در این تحقیق به بررسی نقش رزیدوی موقعیت 19 اکورین، موقعیت متناظر r39 در نمیوپسین پرداخته شد. با توجه اندک تغییرات فعالیت جهش یافته های m19k و m19r اکورین میتوان بیان کرد که این دو جایگاه از نظر تکاملی اگرچه در تطبیق توالی متناظراند اما در ساختار و عملکرد، نقشهای متفاوتی دارند. با انجام داکینگ کلنترازین با نمیوپسین مشاهده شد که احتمالا کروموفور در حفره ی نمیوپسین بسیار متفاوت از اکورین قرار میگیرد. به منظور تأیید آن، جهش d156n انجام شد که منجر به کاهش چشمگیر فعالیت نمیوپسین گردید.

در این مطالعه آنزیم مالتوژنیک آمیلاز (maase) از سویه جدید geobacillus ترموفیلیک مورد برسی قرار گرفت. این آنزیم بیشینه فعالیت خود را در محدوده ای گسترده، بین 55- 65°c، نشان می دهد که از دیگر آنزیم های maase دیمر گزارش شده، بالاتر است. ph بهینه برای فعالیت آن 6 است و فعالیت کاتالیزوری آن به وسیله li+ و k+ افزایش می یابد. این آنزیم به طور قابل توجهی ?-، ?- و ?-cyclodextrin را به عنوان سوبسترا نسبت به سوبستراهای پلیمری (آمیلوز، آمیلوپکتین، گلیکوژن و نشاسته ) ترجیح می دهد. توالی آمینو اسیدی آنزیم 588 باقیمانده آمینو اسیدی و وزن مولکولی آن در حدود 65 kda است. در این تحقیق با توجه به کاربردهای جدیدی که برای آنزیم مالتوژنیک آمیلاز وجود دارد به بررسی اثر افزودنی های گلیسرول، بتائین، سوربیتول، اوره و گوانیدین- هیدروکلراید در غلظت های متفاوت بر ساختار و پایداری این آنزیم پرداخته شد و همچنین با توجه به نقش الیگومریزاسیون در مواردی نظیر پایداری، کارایی و ویژگی سوبسترایی آنزیم، پارامترهای ترمودینامیکی انتقال مونومر/ دیمر مورد بررسی و مطالعه قرار گرفت. همچنین بر اساس مطالعات قبلی انجام شده بر روی این آنزیم، مشخص شده است که تجمع این آنزیم بسیار بالاست، بنابراین در این تحقیق با استفاده از تغییر شرایط و حلال در آزمایشگاه، سعی شد این مشکل رفع گردد. نتایج کسب شده از بررسی های سینتیکی به روش طیف سنجی مرئی-فرابنفش، مطالعات ساختاری با استفاده از تکنیک های طیف سنجی دورنگ نمایی دورانی (cd) و فلورسانس و مطالعات ترمودینامیکی با استفاده از تکنیک کالریمتری روبشی تفاضلی (dsc)، نشان دادند که فعالیت و پایداری سینتیکی آنزیم مالتوژنیک آمیلاز در حضور افزودنی های بتائین و سوربیتول افزایش می یابد. و در حضور گلیسرول علیرغم افزایش پایداری سینتیکی و ترمودینامیکی، فعالیت کاهش می یابد. بنابراین دو افزودنی بتائین و سوربیتول برای بهینه سازی فعالیت و پایداری آنزیم کاربردی تر هستند. همچنین نتایج بررسی پارامترهای ترمودینامیکی انتقال مونومر/دیمر با استفاده از دو روش cd و dsc نشان دهنده تاثیر اندک دایمریزاسیون در پایداری آنزیم بود.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

در این پژوهش، جنبه های مورفولوژیک اووسیت ماهی سفید دریای خزرrutilus frisii kutum (kamensky, 1901) از جمله بافت شناسی تکوینی اووسیت و تغییرات مورفولوژیک داخلی ترین لایه اووسیت (زونارادیاتا) طی مراحل مختلف رشد تخمدان و جنبه های فیزیولوژیک اووسیت از جمله اندازه گیری هورمونهای جنسی ‏(17بتا- استرادیول، تستسترون، پروژسترون و 17آلفا- هیدروکسی پروژسترون)، کاتیونها (سدیم‏، پتاسیم و کلسیم)، اسمولاریته و پروتئین توتال پلاسمای خون در مراحل مختلف تکوین اووسیت در دو محیط متفاوت اکولوژی یعنی دریای خزر و رودخانه های منتهی به آن مورد بررسی قرار گرفت. ماهی سفید، بومی دریای خزر بوده و به لحاظ شیلاتی یکی از مهمترین ماهیان اقتصادی حوزه جنوبی دریای خزر است که طی مهاجرت آنادرومیک تخمریزی خود را در رودخانه ها انجام می دهد. مراحل رشد تخمدان بر طبق مشاهدات بافت شناسی در زیر میکروسکوپ نوری شامل شش مرحله 1) رشد اولیه اووسیت، 2) دورهستکی، 3) آلوئل کورتیکال، 4) زرده سازی، 5) رسیدگی، 6) تخمریخته می شود. مطالعات بافت شناسی نشان می دهد که این ماهی تا انتهای مرحله زرده سازی که اسفندماه می باشد در دریا حاضر است و پس از آن با شروع مرحله رسیدگی مهاجرت آنادرومیک ماهی شروع شده و عمل تخمریزی نیز در رودخانه ها صورت می گیرد. تغییرات مورفولوژیک لایه زونارادیاتا که بوسیله میکروسکوپ نوری و الکترونی در دو محیط اکولوژی متفاوت بررسی شد با مراحل تکوینی اووسیت ارتباط تنگاتنگی داشت بطوریکه تا مرحله زرده سازی ضخامت لایه زونارادیاتا و میکروویلی های گسترش یافته از سطح آن روند افزایشی داشتند و پس از اتمام زرده سازی آنها نیز روند نزولی را در پیش گرفتند. حداکثر ضخامت زونارادیاتا (61/1±92/14 میکرومتر) و حداکثر طول میکروویلی ها(3/2±75/10 میکرومتر) در انتهای مرحله زرده سازی حاصل شد. در تخم لقاح یافته زوائدی جهت چسبندگی برروی میکروویلی ها و منافذی بر روی سطح تخم مشاهده شد. اندازه گیری هورمونهای جنسی در پلاسمای خون طی دوره تولید مثلی ماهی سفید نشان داد که دو هورمون 17بتا- استرادیول و تستسترون در فاز رشد اووسیت یعنی تا انتهای مرحله زرده سازی در دریا، روند صعودی داشتند و سپس سطح آنها نزول یافت در حالیکه در فاز رسیدگی اووسیت یعنی تا تخمریزی ماهی در رودخانه، دو هورمون پروژسترون و 17آلفا- هیدروکسی پروژسترون سیر صعودی داشته و پس از تخمریزی سطح آنها نیز کاهش یافت. بیشترین غلظت هورمون 17بتا- استرادیول (69/19±43/133 نانوگرم در میلی لیتر) و تستسترون (44/1±99/6 نانوگرم در میلی لیتر) در اسفندماه همزمان با انتهای مرحله زرده سازی اندازه گیری شد اما بیشترین غلظت هورمون پروژسترون (37/0±60/2 نانوگرم در میلی لیتر) و 17آلفا- هیدروکسی پروژسترون (25/2±02/4 نانوگرم در میلی لیتر) در ماه فروردین همزمان با رسیدگی اووسیت بدست آمد. اندازه گیریهای کاتیونهای سدیم‏، پتاسیم و کلسیم بهمراه اسمولاریته پلاسمای خون در مراحل مختلف تکوین اووسیت نشان می دهد که یون سدیم و کلسیم تا رسیدگی ابتدایی (14 فروردین ماه) متحمل تغییرات زیادی نشده و فقط در مرحله رسیدگی نهایی (26 فروردین ماه) سطح آنها کم شده و اختلاف معنی داری با گروههای قبلی پیدا کردند (p<0.05) در حالیکه پتاسیم این روند نزولی را از اواخر اسفند ماه با شروع مهاجرت آغاز کرده و دچار افت شدید و اختلاف معنی داری در مرحله رسیدگی شد (p<0.05). اسمولاریته پلاسما که بیشتر متاثر از غلظت یونهای سدیم و پتاسیم است روندی مشابه با پتاسیم را طی می کند. اندازه گیری میزان پروتئین توتال پلاسمای خون در مراحل مختلف تکوین اووسیت نشان داد که از مرحله آلوئل کورتیکال تا رسیدگی ابتدایی در مقدار پروتئین اختلاف معنی داری در این شاخص وجود ندارد (p>0.05) اما قبل و بعد این مراحل اختلاف معنی دار در میزان آن دیده شد (p<0.05). همچنین همبستگی مثبت قوی (r=0.88) بین یون کلسیم و پروتئین پلاسمای خون ماهی دیده شد.

در ایران جمعیتهای مختلف از مولدین ماهی قزل آلای رنگین کمان وجود دارند که در مراکز تکثیر و پرورش نگهداری می شوند. در حال حاضر به دلیل تلاقی بیش از حد بین خانوادگی (inbreeding) در این ماهیان، کاهش تولید و تلفات زیاد در لارو و بچه ماهیان قزل آلا در کشور گزارش شده است و این ضرورت مطالعاتی در مورد ماهیان مولد مراکز تکثیر و تویدکننده بچه ماهی را می طلبد تا بتوان بانک مولدین بومی را از میان آنها انتخاب نمود. همچنین به منظور حفظ تنوع ژنتیکی جمعیتها و پیاده نمودن برنامه های اصلاح نژادی اطلاعاتی راجع به ساختار ژنتیکی آنها مورد نیاز است . در این راستا برای شناسایی جمعیتهای قزل آلا و تعیین تنوع و مارکرهای ژنتیکی از سه جمعیت نمونه برداری به عمل آمد (50 نمونه) و dna میتوکندری آنها (با روش pcr-rflp) مورد بررسی قرار گرفت . آنالیز rflp روی قطعه ای از mtdna (ژن 12srrna، ژنهای trna-f, p, t و ناحیه d-loop و قطعه ای از ژن cyt.b) که توسط pcr تکثیر یافت با استفاده از هضم آنزیمهای محدودگر (12 آنزیم) و الکتروفورز ژل آگارز و پلی اکریل آمید انجام شد. نتایج حاصل تا حدودی تلاقی بین خانوادگی و کاهش تنوع (variation) ژنتیکی را تایید نمود.